sHLA-A*2402融合蛋白的制备与特性研究

本文用含有HLA-A*2402重链胞外段基因的质粒为模板进行PCR,利用下游引物拼接上依赖BirA的可生物化序列后,构建融合基因sHLA-A*2402-BSP,与质粒pET-21d重组后,在宿主菌E.coliBL21(DE3)中诱导表达。表达的融合蛋白与β2m及HLA-A*2402限制性抗原肽EB病毒BRLF1蛋白中的九肽NH2-TYPVLEEMF-COOH进行复性折叠,形成HLA-A*2402-抗原肽复合物单体,并用Westernblot和夹心ELISA法鉴定。证实成功地制备出sHLA-A*2402-生物素化序列融合蛋白并使之正确折叠复性。为研究在原核系统中表达、纯化与复性及体外构建MHCI类分子四聚体,探讨免疫识别机制奠定了基础。

HMGA1、sHLA-G联合TSGF检测在宫颈癌早期筛查及病情评估中的应用

目的分析血清高迁移率族蛋白A1(HMGA1)、可溶性白细胞G抗原(sHLA-G)联合恶性肿瘤特异生长因子(TSGF)检测在宫颈癌早期筛查及病情评估中的应用价值。方法选取2019年2月至2022年2月安徽医科大学第二附属医院收治的110例宫颈癌患者(恶性组),另选取本院同期收治的宫颈上皮内瘤变110例作为良性组,及健康体检女性110名作为对照组。受试对象均进行HMGA1、sHLA-G、TSGF检测。对比三组HMGA1、sHLA-G、TSGF表达水平,收集恶性组患者资料,对比不同临床分期、分化程度、淋巴结转移者HMGA1、sHLA-G、TSGF表达水平,绘制ROC曲线分析HMGA1、sHLA-G、TSGF联合检测对宫颈癌筛查的价值。结果HMGA1、sHLA-G、TSGF表达水平由高到低依次为恶性组>良性组>对照组,比较差异有统计学意义(P<0.05)。临床Ⅲ-Ⅳ期、低分化、淋巴结转移者HMGA1、sHLA-G、TSGF表达水平分别高于临床Ⅰ~Ⅱ期者、中-高分化、淋巴未转移者,差异有统计学意义(P<0.05)。依据ROC曲线可知,HMGA1、sHLA-G、TSGF对宫颈癌诊断AUC值分别为0.781(95%CI:0.699~0.861)、0.706(95%CI:0.607~0.804)、0.722(95%CI:0.629~0.816),HMGA1+sHLA-G+TSGF联合诊断的AUC值为0.813(95%CI:0.717~0.896),高于三者单独检测(P<0.05)。结论HMGA1、sHLA-G、TSGF表达水平与宫颈癌恶性程度相关,三者联合检测可提高宫颈癌早期筛查效能,或可作为宫颈癌筛查及诊断的指标应用于临床。

HBV抗原肽-HLA-A*2402复合物四聚体的构建及初步检测应用

目的:构建2种HBV抗原肽-HLA-A*2402复合物四聚体,并初步用该2种四聚体检测针对不同抗原肽特异性的细胞毒性T细胞(CTL)。方法:原核高效表达HLA-A*2402-BSP和β2m蛋白后,分别与乙型肝炎病毒抗原肽Pol756-764和Core117-125在体外复性折叠成可溶性的HLA-A*2402抗原肽复合物单体,经BirA酶作用并通过凝胶过滤层析法纯化复合物单体,分别将复合物单体与藻红蛋白标记的链霉亲和素按一定比例耦合构建成2种HBV抗原肽四聚体。最后进行流式细胞术检测。结果:Dot-ELISA和ELISA检测显示获得了2种具有天然构象的生物素化的HBV抗原肽-HLA-A*2402复合物单体。结论:构建的2种四聚体可以检测乙型肝炎感染者体内特异性的CTL。

生物素化的HLA-A*2402-抗原肽复合物的制备

目的制备生物素化的HLA-A*2402-抗原肽复合物。方法将原核高效表达的sHLA-A*2402-BSP融合蛋白及β2m和HLA-A*2402限制性抗原肽EB病毒BRLF1蛋白中的九肽NH2-TYPVLEEMF-COOH进行稀释、复性、折叠,形成HLA-A*2402-抗原肽复合物单体,并在BirA酶作用下进行生物素化,使生物素结合到HLA-A*2402-抗原肽复合物中H链C端的BSP序列上形成生物素化的sHLA-A*2402-抗原肽复合物单体。利用特异性单克隆克体(W6/32和兔抗人2β微球蛋白抗体)及链霉亲合素进行ELISA和Western blot,检测稀释复性和生物素化的折叠产物。结果折叠复合物中,主要含有HLA-A*2402-肽复合物单体及β2m两种成分,其中HLA-A*2402-肽复合物单体可生物素化。结论成功制备出生物素化的HLA-A*2402-抗原肽复合物单体,为进一步构建四聚体及制备人工抗原提呈细胞奠定了基础。

HLA-A^＊2402-BSP在大肠杆菌中的优化表达及其四聚体的制备和鉴定

HLA-A*2402是中国人群中最常见的等位基因之一,为研究该基因型人群的人巨细胞病毒(HCMV)特异性细胞毒T细胞(CTL)免疫应答,需要制备负载相应抗原肽的HLA-A*2402四聚体。以RT-PCR方法克隆HLA-A*2402重链基因的cDNA,并构建了羧基端融合生物素化酶BirA底物肽(BSP)的HLA-A*2402重链胞外域融合蛋白(HLA-A*2402-BSP)的表达载体,但该载体不能在大肠杆菌(E.coli)中有效表达HLA-A*2402-BSP融合蛋白;通过对氨基端(N端)区域编码区的密码子进行优化,构建了同义突变的HLA-A*2402-BSP表达载体,融合蛋白在E.coli中获得了高效表达。进而制备了负载HLA-A*2402限制性HCMVpp65341-349抗原肽(QYDPVAALF,QYD)的可溶性HLA-A*2402-QYD单体分子和四聚体,获得的四聚体具有与HLA-A24+供者抗原特异性CTL的结合活性,特异性CTL的频率为总CD8+T细胞的0·09%～0·37%。这些结果为进一步研究HLA-A*2402限制性的特异性CTL免疫应答规律奠定基础。

丙型肝炎病毒HLA-A*1101和A*2402限制性CD8^+T细胞表位的研究

目的:鉴定出丙型肝炎病毒(HCV)特异性HLA-A*1101限制性和A*2402限制性CD8+T细胞表位。方法:采用T细胞表位预测软件SYFPEITHI预测HCV特异性CD8+T细胞表位,合成HLA-A*1101限制性、A*2402限制性候选表位;建立永生化的HLA-A*1101阳性、A*2402阳性B细胞株,采用竞争性肽结合实验检测候选表位与HLA-A*1101或A*2402分子的结合力;候选表位体外分别刺激HLA-A*1101阳性或A*2402阳性HCV感染者外周血单个核细胞(PBMCs)后,采用酶联免疫斑点(ELISPOT)和细胞内细胞因子染色(ICS)实验分别检测肽特异性分泌γ-干扰素(IFN-γ)的细胞的水平和肽特异性IFN-γ+CD8+T细胞的水平。结果:5条HLA-A*1101限制性候选表位中,NS3_609(ITLTHPITK)和NS2_165(VVFSDMETK)与HLA-A*1101分子具有高结合力。3条HLA-A*2402限制性候选表位中,NS3_373(KCDELASKL)和NS5b_382(YYLTRDPTI)与HLA-A*2402具有高结合力;在HLA-A*1101阳性HCV感染者PBMCs中存在NS3_609和NS2_165特异性分泌IFN-γ的CD8+T细胞,而在HLA-A*2402阳性HCV感染者PBMCs中存在NS3_373和NS5b_382特异性分泌IFN-γ的CD8+T细胞。结论:本研究证实NS3_609(ITLTHPITK)和NS2_165(VVFSDMETK)为全新的HCV特异性HLA-A*1101限制性CD8+T细胞表位,NS3_373(KCDELASKL)和NS5b_382(YYLTRDPTI)为全新的HCV特异性HLA-A*2402限制性CD8+T细胞表位。

早期妊娠中血清sHLA-G水平与妊娠结局的关系

目的通过定量测定孕妇早期妊娠血清中的可溶性人白细胞抗原G(sHLA-G)的表达,探讨sHLA-G的表达水平与妊娠结局的关系。方法收集35例孕30d左右孕妇,20例未孕妇女外周血清,采用ELISA法定量检测样本中sHLA-G的表达;比较早期妊娠、早期自然流产和未孕妇女三组sHLA-G的表达水平。结果早期妊娠组血清中sHLA-G的表达水平为(62.35±1.02)U/mL,原因不明性流产组为(27.74±0.95)U/mL,未孕组为(20.56±0.79)U/mL,其中早期妊娠组血清中sHLA-G的表达水平高于原因不明性流产组(P<0.01)和未孕组(P<0.01),差异有显著性。结论妊娠早期孕妇血清中sHLA-G与妊娠成功有直接关系,sHLA-G降低可能会导致原因不明性流产的发生。

慢性特发性血小板减少性紫癜患者血清sHLA-G水平测定的临床意义

目的探讨血清可溶性人类白细胞抗原G(sHLA-G)在慢性特发性血小板减少性紫癜(CITP)中的表达及临床意义。方法采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测76例初治慢性ITP患者治疗前后血清中sHLA-G水平。结果 CITP患者治疗前sHLA-G水平明显高于对照组(P<0.05)。经治疗缓解后患者血清sHLA-G水平与治疗前相比明显下降(P<0.05)。未缓解者sHLA-G水平与初诊患者无明显差异(P>0.05)。结论 sHLA-G可能参与了CITP的发病,检测sHLA-G水平变化有助于慢性特发性血小板减少性紫癜病情判断,可作为疗效观察的新指标。

噬血细胞综合征患者血清sHLA-G表达及其临床意义

本研究旨在探讨血清可溶性人类白细胞抗原G(sHLA-G)在噬血细胞综合征(HPS)患者中的表达水平及临床意义。收集2008年9月至2010年7月经首都医科大学附属北京友谊医院确诊的HPS患者23例,根据不同病因分为感染相关性HPS、肿瘤相关性HPS和风湿免疫病相关性HPS,同时收集25例健康人血清,分别采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测患者及健康人血清sHLA-G水平,并与各实验室检查指标进行相关性分析。结果表明,HPS患者组血清sHLA-G水平高于健康对照者,差异有显著统计学意义(p=0.003),对HPS患者组中不同病因人群进行单因素方差分析,差异无统计学意义(p=0.233)。检测HPS患者血清sHLA-G水平与采血当日WBC、Hb、Plt、ALT、AST、LDH、ALB、TBil、DBil、IBil、Cr、BUN、TG、纤维蛋白原、铁蛋白的相关性发现,其与血小板水平呈正相关关系,与其他各项实验室指标均无相关性。结论:血清sHLA-G水平在HPS患者中升高可能有多种原因,包括感染、肿瘤、T淋巴细胞过度活化以及一些细胞因子的刺激等,sHLA-G还可以抑制NK细胞活性,导致异常免疫风暴形成,在HPS的发病机制中可能起到一定作用。

sHLA-A*020-1抗原肽复合物的构建

以原核表达的sHLA A 0 2 0 1 BSP为重链 ,β2 m为轻链 ,与人工合成的EBV抗原肽LMP2A (4 2 6 4 34、NH2 CLGGLLTMV COOH )利用稀释法进行共折叠复性 ,形成可生物素化的可溶性HLA A 0 2 0 1抗原肽复合物。并利用仅与天然构象HLAI类分子结合的单抗W6 / 32 ,通过Dot ELISA和Westernblot对折叠产物的构象进行鉴定 ,证实复性后成功获得了天然构象的sHLA A 0 2 0 1 抗原肽复合物。为进一步组装可溶性HLA/抗原肽四聚体以及制备人工抗原提呈细胞奠定基础。

复发性生殖器疱疹治疗前后血浆sHLA-G水平及细胞免疫的研究

目的测定复发性生殖器疱疹(RGH)患者治疗前后的外周血T淋巴细胞亚群、NK细胞表达水平及s HLAG水平,了解患者治疗前后的免疫状态改变。方法采用酶联免疫吸附法和流式细胞仪分别检测60例RGH患者和42例健康对照组血浆s HLA-G水平及外周血T淋巴细胞亚群、NK细胞表达水平;采用相同的方法检测60例RGH患者口服盐酸伐昔洛韦和匹多莫德片4个月后血浆s HLA-G水平及外周血T淋巴细胞亚群、NK细胞表达水平。结果 RGH患者CD+4细胞数量低于健康对照组;血浆s HLA-G水平高于健康对照组;RGH患者治疗后CD+3T细胞(总T淋巴细胞)、CD+4T细胞、CD+8T细胞、NK细胞的数量均高于治疗前的水平,血浆s HLA-G水平治疗后低于治疗前。结论 RGH患者存在免疫系统功能紊乱,抗病毒联合免疫调节剂治疗可以予以纠正。

血清sHLA-G水平和绒毛中HO-1蛋白的表达与早期流产的相关性研究

目的探讨血清可溶性人类白细胞抗原-G(sHLA-G)水平及绒毛中血红素氧合酶-1(HO-1)蛋白的表达与早期流产的相关性。方法选择非自愿正常早期妊娠的患者60例作为对照组,自然流产患者80例,分为先兆流产组40例,稽留流产组40例,分别用ELISA法和免疫组化二步法分别检测血清sHLA-G水平和绒毛中HO-1蛋白的表达。结果相应的sHLA-G水平和HO-1蛋白表达由高到低依次排序为对照组、先兆流产组、稽留流产组,差异均有统计学意义(P<0.05或0.01)。结论血清sHLA-G水平和绒毛中HO-1蛋白的表达与早期流产的发生、发展密切相关。

系统性红斑狼疮患者sHLA-Ⅰ类分子的定量检测及意义

目的 :定量检测湖南SLE患者的sHLA -Ⅰ类分子水平。方法 :采用ELISA双抗夹心法检测血浆的sHLA -Ⅰ类分子水平。结果 :血浆sHLA -Ⅰ类分子水平 :2 6例活动期SLE患者为 970 .46± 34 2 .79μg/L ,2 9例非活动期SLE患者为 719.93± 10 2 .2 4μg/L ,37例正常人为 5 5 8.18± 189.6 9μg/L ,与正常人相比SLE活动期 (P <0 .0 1)和非活动期 (P <0 .0 5 )均明显增高 ,且活动期明显高于非活动期 (P <0 .0 1)。结论 :活动期和非活动期SLE患者血浆的sHLA -Ⅰ类分子水平明显增高 。

可溶性sHLA-G在子痫前期患者与正常晚孕妇女血中的表达

目的探讨可溶性白细胞抗原G(sHLA-G)在子痫前期发病中的意义。方法采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定45例子痫前期患者,49例正常足月妊娠者外周静脉血及靠近胎盘部位处脐静脉血中可溶性(sHLA-G)水平。结果子痫前期组外周血sHLA-G浓度为(6.61±2.51)μg/L,正常组外周血sHLA-G浓度(22.03±3.12)μg/L,两组比较差异有统计学意义(P<0.05);子痫前期组脐静脉血sHLA-G浓度为(7.23±2.12)μg/L,正常组脐静脉血sHLA-G浓度(25.21±3.70)μg/L,差异有统计学意义(P<0.05);子痫前期组外周血sHLA-G浓度为(6.61±2.51)μg/L,脐静脉血sHLA-G浓度为(7.23±2.12)μg/L,差异无统计学意义(P>0.05);正常组外周血sHLA-G浓度(22.03±3.12)μg/L,脐静脉血sHLA-G浓度(25.21±3.70)μg/L,两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论妊娠妇女血中sHLA-G水平的下降可能导致子痫前期的发病,血中sHLA-G主要来源于胎盘组织。

复发性生殖器疱疹sHLA-G及外周血T细胞亚群和NK细胞的表达

目的:明确复发性生殖器疱疹(RGH)患者治疗前后外周血T细胞亚群和NK细胞及sHLA-G水平变化。方法:采用酶联免疫吸附法和流式细胞仪分别检测60例RGH患者治疗前后血浆sH LA-G水平及外周血T细胞亚群和NK细胞表达。结果:RGH患者血浆sH LA-G水平治疗前后分别为(11.03±14.57)U/mL和(0.41±0.45)U/mL,差异有统计学意义(P<0.05);NK细胞治疗前后分别为(15.01±5.89)%和(17.72±5.56)%,差异有统计学意义(P<0.05)。CD3^+T细胞、CD4^+T细胞、CD8^+T细胞及CD4^+/CD8^+治疗前后差异无统计学意义(P>0.05)。结论:外周血sH LA-G及NK细胞表达可能与RGH患者病情发展有关。

可溶性HLA-A*2402-pBRLF1复合物的体外折叠与四聚体化

目的研究可溶性HLA-A*2402-pBRLF1复合物的体外折叠与四聚体化。方法将原核高效表达的可溶性HLA-A*2402-BSP融合蛋白及β2微球蛋白(β2m)与HLA-A*2402限制性抗原肽Epstein-Barr病毒(EBV)即刻早期BRLF1蛋白中的九肽NH2-DYNFVKQLF-COOH进行稀释复性折叠,形成HLA-A*2402-pBRLF1复合物单体,并在BirA酶的作用下进行生物素化,使生物素结合到HLA-A*2402-pBRLF1复合物中H链C端的BSP序列上形成生物素化的可溶性HLA-A*2402-pBRLF1复合物单体。利用特异单抗(W6/32和兔抗人β2m抗体)及链霉亲合素进行ELISA和Western blot,检测稀释复性和生物素化的折叠产物。然后用此生物素化的单体分子进一步构建成HLA-A*2402-pBRLF1四聚体来检测人工抗原提呈细胞(aAPCs)诱导的特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)。结果折叠复合物中,主要含有HLA-A*2402-pBRLF1复合物单体及β2m两种成分,其中HLA-A*2402-pBRLF1复合物单体可生物素化和四聚体化。应用HLA-A*2402-pBRLF1四聚体对特异性CTL检测结果说明体外成功地构建了HLA-A*2402-pBRLF1四聚体。结论HLA-A*2402-pBRLF1四聚体构建成功,为特异性CTL的检测提供了有力的工具。

急性白血病患者血清sHLA-G水平测定的临床意义

目的:探讨血清sHLA-G在急性白血病中的临床意义。方法:采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测124例急性白血病患者血清中sHLA-G水平。结果:急性白血病初诊患者血清sHLA-G水平明显高于正常对照组(P<0.05),完全缓解期sHLA-G水平恢复正常,未缓解和复发患者sHLA-G水平与初诊患者无明显差异(P>0.05)。结论:sHLA-G表达水平变化可能与急性白血病的病情发展、疗效及预后有关。

sHLA-G检测及胚胎植前筛选

目的探讨胚胎植前筛选以提高胚胎移植成功率。方法单胚培养体外受精胚胎,ELISA方法检测移植成功组与失败组胚胎培养上清液sHLA-G水平,并比较培养上清中sHLA-G与胚胎HLA-G mRNA表达的相关性。结果胚胎移植成功组sHLA-G水平显著高于未成功受孕组;sHLA-G>10 ng/ml移植组受孕成功率60.9%,sHLA-G<5 ng/ml成功率11.5%。结论sHLA-G是植前筛选良好指标,能提高胚胎移植成功率。

sHLA-G与母胎免疫耐受

免疫学观点认为，妊娠是一种特殊类型的“半同种异体移植”现象，母胎免疫耐受是维持正常妊娠的基础，妊娠失败多与母体免疫调节功能异常对胚胎产生免疫排斥有关，因此阐明母胎界面免疫调节机制一直是生殖免疫学的研究热点。

系统性红斑狼疮患者血浆sHLA-G表达及其影响因素分析

目的检测系统性红斑狼疮(SLE)患者血浆可溶性HLA-G(sHLA-G)水平,并分析HLA-G基因多态性、病情及药物治疗对其表达的影响。方法酶联免疫吸附法(ELISA)检测其中96例SLE患者及74名正常人血浆sHLA-G水平。聚合酶链式反应(PCR)检测HLA-G 14bp插入/缺失多态性基因,收集记录SLE疾病活动性指数(SLEDAI)和药物治疗情况,并分析基因多态性、病情及药物治疗对sHLA-G表达的影响。结果血浆sHLA-G水平在SLE患者为230.2±192.2U/ml,显著高于健康体检者的118.3±38.1U/ml(P=0.0001);HLA-G 14bp插入/缺失多态性位点和基因型在血浆sHLA-G水平增高和正常SLE患者中的分布无显著性差异(P>0.05);但血浆sHLA-G水平增高的SLE患者较血浆sHLA-G水平正常患者病情更重(P=0.027),易出现中枢神经系统受累(P=0.007)。激素、免疫抑制剂及抗疟药等不同药物治疗在血浆sHLA-G水平增高和正常SLE患者间亦无统计学差异(P>0.05)。结论 SLE患者血浆sHLA-G水平增高,而且与SLE病情较重、中枢神经系统受累有关,提示sHLA-G在SLE病理过程中可能发挥重要作用。