基于黏膜sIgA抗体的非洲猪瘟病毒感染早期血清学检测方法的建立

目前的非洲猪瘟病毒(ASFV)血清学检测方法存在因采血引起交叉感染风险、抗体转阳滞后影响检测敏感性等问题,因此建立一种无创采样且可实现早期诊断的血清学方法对于在临床上ASFV感染的诊断与监测有重要意义。本研究以人工合成的方式构建了pFastbac1-P30-His重组表达载体,利用杆状病毒-昆虫细胞真核表达系统表达ASFV重组P30蛋白(SUMO-P30),用Ni柱亲和纯化后作为包被抗原,经过一系列条件优化,建立一种以猪口腔液中黏膜sIgA抗体为靶标的ASFV抗体间接ELISA方法。结果显示,真核重组表达的P30蛋白(SUMO-P30)约为47 ku,Western blot鉴定显示其具有良好的反应原性;经优化确定了ELISA最佳反应条件:包被量为1.0μg·mL^(-1),5%脱脂乳为最佳样品稀释液,与待检口腔液的最佳混合比例为2∶8,样品反应时间为120 min,鼠抗猪IgA-HRP最佳稀释度为1∶5000,反应时间为60 min,最佳显色时间为15 min。该方法检测ASFV感染口腔液抗体效价可达1∶32,与猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒黏膜抗体阳性口腔液均无交叉反应,具有良好的敏感性和特异性。利用该方法和ASFV商品化ELISA血清抗体检测试剂盒,分别检测感染ASFV强毒株或人工致弱株后同一头猪不同时间点的口腔液和血清样品,口腔液中黏膜sIgA抗体在感染后3~5 d S/P值就显著提升,而血清抗体在监测期内未检测到转阳。检测人工感染或同圈感染自然变异株后不同时间点的口腔液和血清样品,本研究建立的方法与商品化非洲猪瘟病毒血清抗体检测试剂盒检测的阳性符合率为100%,阴性符合率为37.5%,总符合率为61.5%。综上,本研究建立了一种无需采血,以口腔液为样品的ASFV黏膜sIgA抗体ELSIA检测方法,可实现ASFV感染的无创、早期、敏感诊断,为ASFV的监测和防控提供新的技术支持和补充。

适合早期诊断的非洲猪瘟sIgA抗体量子点免疫层析检测方法建立

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒感染引起的一种烈性猪传染病,其极高的传染性和发病率给养猪产业造成了巨大的经济损失。目前尚无安全有效的ASF疫苗,因此早期监测是防控ASF最重要的解决方案之一。建立敏感、快速的ASF现场即时检验方法,对维护生猪产业繁荣具有重要意义。首先基于氨基和羧基的偶联反应制备量子点微球(quantum dot microsphere,QDM)偶联ASFV重组抗原蛋白p30的检测探针和QDM-兔抗鸡IgY质控探针;接着在检测线和质控线分别固定鼠抗猪IgA-Sc片段抗体和鸡IgY蛋白制备侧向流免疫试纸条;待检动物口腔液中的ASF sIgA抗体经QDM-p30捕获可被固定至T线。将ASFV阳性口腔液以2倍梯度稀释,检测该方法的灵敏度。通过检测其他几种常见猪病病毒验证该方法的特异性。通过检测ASFV阴性和阳性动物的口腔液临床样本评价该方法的临床诊断效能。该方法特异性好,与PRV、CSFV、PRRV不存在交叉反应;灵敏度高,最低检出稀释度可达1∶64;耗时短,可在20 min内完成检测;操作便捷,无需侵入式采样;检出时间早,人工感染最早可于感染后第6天检出。本研究开发了一种口腔液中ASF sIgA抗体的现场即时检验(point-of-care testing,POCT)量子点免疫试纸条,为ASFV的监测和防控提供了新的技术支持和补充。

猪流行性腹泻病毒特异性SIgA抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

【目的】快速了解猪群感染猪流行性腹泻病毒或免疫猪流行性腹泻病毒相关疫苗后猪群特异性SIgA抗体水平。【方法】对猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)ZJ08株进行纯化,采用纯化的病毒作为包被抗原,以辣根过氧化物酶标记的SC(Secretory component,SC)多克隆抗体为标记抗体,通过优化检测条件,建立乳汁中猪流行性腹泻病毒特异性SIgA抗体间接ELISA检测方法。【结果】成功建立了猪流行性腹泻病毒SIgA抗体检测方法。PEDV抗原的最佳包倍浓度为0.6μg·孔−1,样本最佳稀释比例为1∶5,作用时间1 h;SC标记抗体最适稀释比例为1∶100,作用时间1.5 h。建立的ELISA方法能够特异性检测样本中抗PEDV SIgA抗体,与PoRV(Porcine rotavirus,PoRV)、TGEV(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)的阳性乳汁均无交叉反应;批内、批间重复试验的变异系数小于10%,具有良好的特异性和重复性。通过临床采集的乳汁样品测定发现,样本中PEDV IgA抗体阳性率达到98.1%,而采用针对特异性SIgA的抗体方法检测,其阳性率仅为69.2%,样本中IgA和SIgA抗体符合率仅为70.6%,提示仅仅依据PEDV IgA抗体水平并不能很好地反映猪群免疫该疫苗后特异性黏膜免疫的真实水平。【结论】建立的PEDV特异性SIgA抗体检测方法可为分析、评估猪群免疫PEDV疫苗后乳汁中特异SIgA抗体产生及猪群的保护情况提供可靠依据。

猪流感H3N2型病毒特异性sIgA抗体分泌规律研究

目的研究不同品种猪应答猪流感病毒感染,呼吸道分泌特异性sIgA抗体的分泌规律,以及针对不同抗原蛋白sIgA抗体的分泌差异。方法将猪流感病毒A/swine/Nanjing/51/2010(H3N2)滴鼻感染试验猪(1×10~7 TCID50/mL,2mL/头),采集感染后21d内不同时间点的鼻拭子样品,用M1、NS1和PB1三种重组蛋白分别建立的间接ELISA方法检测特异性sIgA抗体,并分析其分泌规律及差异。结果显示针对3种重组蛋白的特异性sIgA抗体在整个检测周期内,分泌规律相似,差异无统计学意义,均表现为感染后第5d特异性sIgA抗体水平迅速升高,第14d达到高峰,随后开始逐渐下降。在不同品种猪之间,仅巴马猪分泌抗PB1蛋白的sIgA抗体在第14d和21d时高于二元猪(P<0.05),而抗M1和抗NS1蛋白的sIgA抗体在两种品种猪之间无统计学差异(P>0.05)。结论初步探索了猪在感染猪流感病毒后特异性sIgA黏膜抗体的分泌规律,为进一步研究SIV黏膜抗体诊断试剂奠定基础。

宫腔分泌物SIgA抗体在免疫性不孕不育患者临床应用

目的建立不孕不育患者宫腔分泌物SIgA抗体ELISA检测方法,以评估不孕不育患者SIgA抗体和血清抗生殖抗体发生率。方法用ELISA方法检测不孕史两年以上妇女997例,其中原发性不孕512例,继发性不育485例,进行血清抗生殖抗体检测,同时取其宫腔分泌物用N-乙酰-L-半胱氨酸溶解后,进行分泌型IgA抗体检测,比较血清型和分泌型IgA抗体阳性率的差异。结果通过ELISA法检测,继发性不孕组AEMAb、ACPAb、ATAb、AHCGAb血清IgG、IgM阳性率均高于原发性不孕组(P<0.05);原发性不孕组AOVAb血清IgG阳性率高于继发性不孕组(P<0.05);ASAb和AZPAb血清IgG、IgM阳性率两组差异无统计学意义(P>0.05);AEMAb、ACPAb、ASAb血清IgA抗体两组阳性率差异无统计学意义(P>0.05),而分泌物SIgA抗体阳性率显著高于血清型IgA抗体(P<0.01)。结论血清AEMAb、AHCGAb、ATAb、ACPAb IgG、IgM是引起继发性不孕症的主要抗体;AOVAb是引起原发性不孕症的主要抗体;AEMAb、ACPAb、ASAb SIgA抗体阳性率均显著高于血清型IgA抗体,宫腔分泌物SIgA抗体是造成免疫性不孕不育的主要局部抗体,可以为不孕不育的诊断、治疗提供依据。

宫腔分泌物SIgA抗体在免疫性不孕不育患者中的临床应用

目的:分析不孕不育女性疾病应用宫腔分泌物SIgA抗体检测进行鉴别诊断的临床价值,为临床提供指导。方法:选择在我院就诊的不孕不育女性患者138例,其中原发性不孕组89例(原发组),继发性不孕组49例(继发组),应用宫腔分泌物SIgA抗体,进行血清型抗生殖抗体检测,同时进行分泌型IgA抗体检测,对比分析两种抗体阳性率。结果:继发组AHCGAb等五项血清型IgG、IgM阳性率均高于原发组(P<0.05);血清型IgG阳性率原发组AOVAb高于继发组(P<0.05);原发组血清型IgA抗体阳性率明显低于分泌物型SIgA抗体(P<0.05)。结论:宫腔分泌物SIgA抗体是造成妇女免疫性不孕不育的主要抗体;导致原发性不孕主要是血清AOVAb抗体;导致继发性不孕症主要是AHCGAb等抗体;临床上应用SIgA诊断不孕不育具有一定的价值,值得临床推广。

ELISA法快速检测菌痢病人粪抗体SIgA的研究

<正>细菌性痢疾是我国主要肠道传染病之一,年发病人数高达300万以上。一直以来,菌痢实验室诊断方法主要依靠细菌培养,但细菌培养的阳性率低,报告结果时间长(一般2~4天),给防治工作带来一定困难。本实验以ELISA法为检测手段,应用痢菌混合LPS为抗原,快速检测菌痢病人粪便中的特异性SIgA抗体,获得了较为理想的结果。材料与方法一、材料1．菌株:福氏志贺氏菌Y变种由上海市卫生防疫站菌种室赠送。宋内氏志贺氏菌、大肠杆菌菌株由本站菌种室保存。2．检测标本:主要来自杭州、湖州、嘉兴等市各大医院。其中细菌培养阳性菌痢病人大便69份;霍乱病人大便70份;轮状病毒阳性病人大便23份;脊灰病毒阳性病人大便22份;伤寒病人大便16份;正常人大便176份。采样时将病人新鲜排出的粪便置灭菌试管内,加橡皮塞,-20℃低温冰箱保存。

丁酸梭菌CB1对肉鸡免疫器官指数、黏膜SIgA抗体和血清生化指标的影响

试验选取1日龄Cobb500肉鸡15000只，随机分为5组，每组3000只，每组3个重复，试验周期为42d，前期1～21d和后期22～42d。试验分组为基础日粮（A组）、基础日粮＋50g／t金霉素（B组）、基础日粮＋100g／t丁酸梭菌CBl制剂（C1组）、基础日粮＋200g／t丁酸梭菌CB1制剂（C2组）、基础日粮＋200g／t丁酸梭菌CB1复合菌制剂（D组），分别在21d和42d时每个重复随机抽取10只鸡进行屠宰取样，测定相关指标。结果显示：丁酸梭菌CB1制剂添加组C1、C2和D组42d法氏囊指数比A组、B组分别提高了347．37％，520％和400％（P〈0．01），脾脏指数比B组显著提高了61．11％，46．67％和31．1l％。c1、c2、D组气管黏膜SIgA水平显著高于A组和B组，c2组、D组肠道黏膜SIgA水平显著高于A组和B组。21d和42d，血糖含量c1、C2、D组与A、B组相比均有所提高，D组显著高于A和B组（P〈0．05）；尿素氮含量C1、C2、D组均低于A组和B组，D组显著低于A和B组（P〈0．05）。21d，D组总胆固醇、肌酐也显著低于A和B组（P〈O．05），但42d差异不显著。结果表明：丁酸梭菌CB1及其复合菌制剂能有效促进法氏囊和脾脏的生长发育，对于后期法氏囊的生长维持作用优于抗生素和基础日粮组；能有效刺激肉鸡气管和肠道体黏膜SIgA的分泌；在一定程度上改善了肉鸡血液生化指标，复合菌制剂组在血糖含量、尿素氮指标显著优于抗生素组。

经口感染弓形虫BALB/c小鼠血清及肠道分泌物中IgA抗体含量的检测

目的研究经口感染弓形虫速殖子小鼠血清及肠道分泌物中IgA含量的变化,探讨肠道粘膜免疫应答机制.方法将6～8周龄BALB/c小鼠100只随机分为对照组和感染组.感染组灌胃接种RH株弓形虫速殖子5×104个/只,对照组给予等量PBS.于感染后第2、4、6、8、10、13、16、19、22、25天,每组各5只小鼠分别处死,摘眼球采血分离血清,收集肠道冲洗液,用ELISA法测定血清及肠液IgA含量.结果对照组血清IgA抗体于第4～8天缓慢升高后保持平稳;感染组小鼠血清IgA水平从第8天起迅速升高,第10天达到高峰,之后迅速下降并接近对照组的水平,第25天再度升高.与对照组相比,感染组血清IgA水平在第10、25天显著升高(P＜0.01).肠液IgA含量明显高于血清,两组小鼠肠道冲洗液中的IgA抗体于第4、6天逐渐升高之后,对照组保持平稳,而感染组于第8天骤然下降并低于升高前的水平,之后又迅速升高,于第13天达到峰值,随后下降并接近对照组水平;第8和13天感染组IgA抗体含量显著低于和高于(P＜0.01)对照组.结论BALB/c小鼠经口感染弓形虫,可有效诱导肠道粘膜的免疫应答,产生高水平的IgA抗体,发挥局部抗虫作用;提示IgA抗体产生变化规律与虫株毒力及小鼠免疫反应特性等因素有关.

以α甘露聚糖肽为佐剂的EV71全病毒灭活抗原黏膜免疫小鼠的抗体应答

目的肠道71型全病毒灭活抗原（EV71Ag）联合α-甘露聚糖肽（PA）佐剂滴鼻免疫，观察全身免疫应答及持续时间。方法5—6周龄BALB／c雌性小鼠随机分为阴性对照组，阳性对照组，高剂量疫苗组，低剂量疫苗佐剂组和高剂量疫苗佐剂组，每组10只。阴性对照组以PBS滴鼻，阳性对照组以EV71Ag肌注给药，免疫组以EV71Ag单独和不同剂量分别配伍PA滴鼻给药。首次给药后第0、2、3、4、5和6周采集血清及鼻肺灌洗液，ELISA法检测血清特异性IgG抗体水平及鼻肺灌洗液sIgA抗体水平，MTr法检测淋巴细胞增殖，中和抗体实验检测小鼠血清中和抗体水平。结果各滴鼻组小鼠血清中均产生一定水平的特异性IgG抗体，高剂量疫苗佐剂组第三次免疫后其血清IgG（2．477±0．500）可达到阳性对照组（3．040±0．120）的80％，佐剂组体外淋巴细胞增殖率较阳性对照组有显著增高（P〈0．05），各滴鼻组血清中和抗体滴度均〉8。结论EV71全病毒灭活联合仪．甘露聚糖肽佐剂免疫小鼠可诱导全身免疫应答，且α-甘露聚糖肽佐剂可增强其作用。

2021年猪流行性腹泻检测分析与防控建议

2021年对全国269个猪场样本进行猪流行性腹泻病毒(PEDV)检测,其中抗原检出率为42.9%,比2020年检出率有所提高,反映了该病防控依然问题多多;而SIgA抗体合格率为58.7%,IgG抗体合格率为52.5%,SIgA抗体合格率略高一些,但抗体整体趋势基本一致,从抗体角度也印证了对该病的防控还有很大的上升空间。

抗禽流感病毒H5N1分泌型IgA在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

分泌型IgA(SIgA)在机体的粘膜免疫中具有重要作用,在外分泌道中比单体IgA和IgG抗体具有更好的抗感染活性。为了表达抗禽流感病毒H5N1人-鼠嵌合分泌型IgA抗体,首先以本室先前构建的稳定表达IgA的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)细胞系为基础,共转染分泌片和J链表达质粒,然后用抗生素Zeocin选择阳性克隆细胞,利用倍比稀释的方法筛选分泌SIgA的单克隆细胞,通过Western blotting分析培养上清中SIgA的表达情况。结果表明,在CHO细胞中成功表达了SIgA抗体,上述研究为研制分泌型IgA抗体制剂奠定了良好的基础。

基因疫苗预防牙周炎的实验研究

目的将已构建的P.gingivaliskgpcd基因的真核重组表达质粒pcDNA3.1+/kgpcd作为基因疫苗,免疫SD大鼠并观察其在预防牙周炎中的作用。方法pcDNA3.1+/kgpcd经颌下腺靶向注射免疫SD大鼠,采用间接ELISA法检测唾液中特异性抗体的水平,并经组织化学染色观察免疫对SD大鼠牙周炎的保护情况。结果重组质粒pcDNA3.1+/kgpcd经颌下腺靶向注射免疫SD大鼠,可诱导机体产生高水平的唾液中抗KGPcdsIgA抗体,显著高于对照组,并且实验组牙槽骨的破坏程度显著低于对照组。结论颌下腺靶向注射免疫可引起有效的黏膜免疫应答,KGPcd作为有效的免疫原产生的抗体对P.gingivali引起的牙周炎可起到保护作用。

流行性感冒病毒免疫性

人体在感染流感病毒后或疫苗接种后可产生特异性的细胞免疫和体液免疫。抗HA和抗NA是流感的特异性抗体。抗HA为中和抗体,因此抵抗感染的发生与抗HA有关,而减轻病情和阻止病毒传播则与抗NA有关,抗NP具有型特异性,只能用于分离病毒的定型。血清抗体和鼻腔分泌物中的sIgA抗体与保护作用有关,