苹果sMdCAX1基因超表达载体的构建及遗传转化

为使sMdCAX1基因能在苹果中高效表达,改善苹果对Ca^(2+)吸收转运的能力,本研究构建了sMdCAX1植物超表达载体并将其通过农杆菌介导法转入长富6号苹果中。根据MdCAX1基因序列设计引物,从长富6号中克隆MdCAX1基因,通过PCR方法截除编码MdCAX1基因的N末端序列,获得sMdCAX1片段。利用重叠PCR方法将sMdCAX1序列中的SacI位点进行定点突变,并在序列两端分别添加BamHI和SacI酶切位点,获得长度为1272bp的突变序列sMd1+2Mu。利用BamHI和SacI双酶切sMd1+2Mu和植物表达载体pYH4215,目的片段经回收、连接、转化和筛选,获得植物双元表达载体pYH4215-sMd1,并将该载体转化农杆菌菌株EHA105。以长富6号无菌试管苗叶片为受体,进行遗传转化获得了转基因植株,经鉴定,有6个株系呈GUS染色阳性,其中2个株系呈PCR阳性。进一步对PCR鉴定阳性的株系进行RT-PCR分析,表明sMdCAX1基因在这2个株系中得到表达。本试验结果为进一步研究苹果MdCAX1基因的功能和通过转基因方法提高苹果果实钙含量奠定了基础。