细菌sRNA来源、作用机制及调控网络研究进展

通过发酵生产工业产品一直是细菌等微生物的研究热点,但是发酵过程中存在的代谢副产物和环境胁迫等问题,限制了工业菌株的发展。sRNA是细菌中普遍存在的一类调控性非编码RNA,它们与核糖开关、双组分系统、转录因子等其他调控元件共同构成了细菌中的复杂调控网络,在代谢调控和抗胁迫中都发挥着异常重要的作用。文章对细菌中sRNA的来源、作用机制以及在调控网络中的角色进行了详细总结,有助于更好地解析细菌的代谢途径及发酵过程中受到的环境限制,对构建低毒力、高鲁棒性菌株,助力工业产品的发酵生产有重要参考意义。

基于16sRNA测序技术探讨不同体质腹型肥胖者肠道菌群特征

目的:探讨痰湿体质与非痰湿体质腹型肥胖人群肠道菌群的丰度及物种差异。方法:共纳入91例不同体质腹型肥胖受试者,收集了91例大便样本,其中痰湿体质受试者44例,非痰湿体质受试者47例。使用NovaSeq6000基因测序仪,对痰湿体质与非痰湿体质受试者肠道菌群相对丰度、物种多样性进行分析。结果:痰湿体质与非痰湿体质腹型肥胖受试者的肠道菌群门纲目科属五个层级菌群相对丰度的差异显著。痰湿体质与非痰湿体质相比门纲目科属五个层级菌群相对丰度以及差别较大,其中拟杆菌、类杆菌、毛螺菌、肠杆菌相对丰度差异有统计学意义(P<0.05)。结论:痰湿体质与非痰湿体质腹型肥胖受试者肠道菌群存在差异,二者间菌群差异可能是形成体质差异的内在因素。

油茶sRNA分析及其对光合油脂代谢的调控

【目的】分析鉴定油茶s RNA的种类、数量和特征,揭示mi RNA及靶基因的功能,为利用mi RNA及靶基因进行油茶遗传改良提供理论依据。【方法】以优良油茶品种‘横冲89’为材料,采集嫩叶和成熟种子,提取总RNA,磁珠分离富集m RNA,利用Illumina RNA-seq高通量测序技术构建s RNA文库,分析s RNA的结构特征、种类和数量、公共序列及特有序列。将s RNA定位到油茶转录组上,分析比对上的总s RNA种类和数量,进行已知mi RNA比对分析和首位碱基偏好性分析。利用mi REvo和mirdeep2软件分析新mi RNA的前体和成熟体,预测新mi RNA,进行mi RNA家族分析;进行mi RNA表达与差异分析、层次聚类分析。最后,进行mi RNA靶基因预测、候选靶基因的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析以及参与光合作用、油酯代谢mi RNAs的表达分析和靶基因筛选。【结果】分别构建了油茶叶和种子的s RNA文库,18~40个核苷酸(nucleotide,nt)的净读长分别为14256189条和10822313条,属于6138179和4980518种s RNA。其中,24-nt sRNA最多。叶和种子s RNA的公共序列为773647种,特有序列分别为4206871种和5364532种。在两个s RNA文库中,比对上油茶转录组参照序列的总读长分别为5855009和4122070条,比对上的mi RNA前体为118种,mi RNA成熟体为78个。研究发现:18~23 nt已知mi RNA首位碱基多偏好U。鉴定出54个新mi RNA,22个已知mi RNA家族,包括105个已知家族成员;67个表达差异mi RNA,调控1346个靶基因。其中,26个mi RNAs为显著差异表达,调控644个靶基因。聚类分析表明:显著差异表达的mi RNA被分为2族,一族在叶和种子中表达较低,另一族则表达较高。GO分析揭示差异表达mi RNA的候选靶基因在生物学过程、细胞组分、分子功能3大类的51个条目中富集。KEGG分析表明:差异表达mi RNA的候选靶基因在萜类主链生物合成、甘油酯代谢、氨酰t RNA生物合成等代谢过程中显著富集。此外,研究发现:ath-mi R5658和gma-mi R169v在叶和种子中差异表达,确定它们分别对应碳固定、光合作用途径中的类NADP依赖型苹果酶、果糖二磷酸醛缩酶1、光系统I反应中心亚基ⅣB,以及甘油脂代谢中的单半乳糖酰二酰基甘油合酶2等靶基因。【结论】初步证实了“一个mi RNA调控多个靶基因,以及多个mi RNA调控一个靶基因的现象”;发现了ath-mi R5658可能调控碳固定代谢、光合作用、甘油磷酯代谢、甘油酯代谢、脂肪酸延长等途径中靶基因的表达,gma-mi R169v可能调控甘油磷酯代谢中靶基因的表达。本结论对于揭示油茶光合碳固定、脂肪酸油脂合成的调控机理,培育优质高产油茶新品种具有一定的理论价值。

sRNA RybB缺失后沙门氏菌的转录组分析

为了探明沙门氏菌在sRNA RybB缺失后的转录组变化情况,试验对沙门氏菌LT2菌株和RybB基因缺失株进行高通量测序,运用DESeq2算法筛选sRNA RybB缺失后的差异表达基因,并对其进行GO功能注释、KEGG信号通路富集分析及EggNOG功能注释,并利用实时荧光定量PCR验证筛选出的10个差异表达基因结果的可靠性。结果表明:共筛选出199个差异表达基因,其中上调基因98个,下调基因101个。差异表达基因GO功能主要注释了酰胺转运、肽转运、大分子蛋白定位等生物学过程,参与了鞭毛组装、双组分系统、沙门氏菌感染、丙酸代谢和NOD样受体信号通路等27个KEGG信号通路,EggNOG功能注释了细胞壁/膜/包膜生物发生、一般功能预测、碳水化合物运输与代谢、氨基酸的转运和代谢等蛋白分类。差异表达基因STM1049、STM1246、STM4504、STM1394、STM1050、STM3600、STM3599、STM3601、STM3598和STM3602的相对表达量与转录组测序结果的变化趋势一致。说明sRNA RybB缺失后会影响细菌的生命活动,以及可直接或间接调节沙门氏菌的各种代谢途径。

溶藻弧菌细胞密度相关sRNA的鉴定及其对毒力的调控作用

溶藻弧菌作为四大致病弧菌之一,可引起鱼虾的系统性疾病以及人类肠道和创伤性伤口感染,其毒力因子的表达及致病性与细胞密度紧密相关.sRNA是存在于细菌中的非编码小RNA,作为转录后调控因子广泛参与细菌的毒力、环境应激、生长代谢等过程.利用转录组测序等手段,在溶藻弧菌中筛选出了显著差异表达的细胞密度相关非编码RNA分子,sRNA0087,并对其二级结构以及靶标mRNA进行预测.通过构建其突变株及回补株,探究了sRNA0087对溶藻弧菌毒力因子的调控作用.实验结果表明,溶藻弧菌在高细胞密度(9 h)相较于低细胞密度共有82个差异表达sRNA,其中47个表达上调,35个表达下调.sRNA0087下调水平最为显著,具有典型RNA二级结构,包含4个茎环结构以及3’端poly(U)结构,其在溶藻弧菌基因组中存在多个潜在靶标mRNA分子.成功构建Δ0087缺失株和0087^(+)回补株,sRNA0087对溶藻弧菌的运动性、生物被膜形成以及胞外蛋白酶的分泌具有显著的促进作用.

沙门氏菌sRNA RybB及伴侣蛋白Hfq对孔蛋白OmpW表达的调控作用

为探究sRNA RybB和伴侣蛋白Hfq对沙门氏菌孔蛋白OmpW表达的调控作用,研究利用λred同源重组系统构建ompW基因lacZ融合菌株,再通过P22噬菌体转导技术构建颜色指示菌株中rybB和hfq相关基因的单缺失株、双缺失株,通过β-半乳糖苷酶活性试验和qPCR分析,确定sRNA RybB及伴侣蛋白Hfq对孔蛋白OmpW表达的调控作用。结果显示:成功构建了颜色指示菌株ΔompW∶∶LacZ和相对应的基因缺失菌株;与标准株LT2相比,ΔhfqY25A、ΔhfqK56A、Δhfq65、Δhfq87基因使ompW蛋白表达水平极显著下调(P<0.01),具有正调控作用,而Δhfq72、Δhfq∶∶tet、ΔrybB、ΔrybBΔhfq∶∶tet基因使ompW蛋白表达水平极显著上调(P<0.01),具有负调控作用;与标准株LT2相比,缺失hfq定点突变和rybB对ompW基因具有负调控作用。研究表明,沙门氏菌伴侣蛋白Hfq及RybB对孔蛋白ompW基因的蛋白表达水平和转录水平产生不同程度的影响,初步阐明了伴侣蛋白Hfq、sRNA RybB和靶基因三者的内在关系,为沙门氏菌减毒活疫苗与新型抗菌药物研制的研究奠定基础。

水生动物致病菌sRNA研究进展

细菌sRNA是一种长度为40~500个核苷酸的非编码的调控小RNA,是细菌重要的转录后调控因子,能迅速响应外界环境,帮助病原菌适应逆境条件和侵染宿主。目前哺乳动物病原菌s RNA已研究的较为深入,但水生动物致病菌s RNA的研究刚起步,亟待加强。本文综述了s RNA调控基因表达的机制及其在水生动物重要致病菌如溶藻弧菌和杀鱼爱德华氏菌等的研究进展,以期为s RNA参与水产致病菌毒力的研究提供思路。

类鼻疽伯克霍尔德sRNA敲除株的构建及生物学功能初步评价

目的:构建类鼻疽伯克霍尔德菌(burkholderia pseudomallei,B. pseudomallei)sRNA基因敲除菌株,并对其生物学功能进行初步评价。方法:设计合成引物9sF/9sR、9xF/9xR、R1/F1,扩增sRNA基因上下游同源臂片段,通过酶切、连接和转化,将目的片段克隆至质粒TPR-pK18mobSacB上,运用同源重组的方法获得类鼻疽伯克霍尔德菌sRNA敲除菌株。结果:类鼻疽伯克霍尔德菌敲除株△sRNA构建成功。与野生株HNBP001比较,△sRNA生长速度、泳动能力、生物被膜形成能力均下降,药敏结果无差异。结论:成功构建类鼻疽伯克霍尔德菌sRNA基因敲除株,为进一步研究sRNA在类鼻疽伯克霍尔德菌中的调控机制提供了基础。

基于mRNA转录组及sRNA测序技术探讨益肾方干预糖尿病肾病的机制

【目的】探讨益肾方(由黄芪、山茱萸、菟丝子等组成)对糖尿病肾病小鼠肾脏的保护作用机制。【方法】将28只db/db小鼠随机分为模型组,益肾方低、高剂量组和洛汀新组,另外设7只同遗传背景的db/m小鼠为正常组,根据分组灌胃干预12周。观察各组小鼠体质量,生化指标血糖、尿微量白蛋白(MAU)、尿微量白蛋白/肌酐比值(UACR)、胱抑素C(Cys-C),肾间质纤维化相关蛋白神经钙黏蛋白(N-cad)、纤维连接蛋白(FN)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和上皮钙黏蛋白(E-cad)表达水平及肾脏病理改变。应用二代高通量测序技术获取小鼠肾脏组织mRNA转录组及miRNA的表达矩阵,对获得的表达矩阵进行差异基因分析,然后使用R语言、DIANA-miRPath网站分别对差异表达mRNA、miRNA进行基因本体论(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析。【结果】(1)与模型组比较,益肾方低、高剂量组小鼠体质量、UACR、MAU、Cys-C水平降低(P<0.05),血糖无显著性差异(P>0.05),肾脏组织E-cad表达升高、N-cad表达降低(P<0.05),FN、α-SMA无显著性差异(P>0.05),肾脏组织病理损伤减轻。在体质量、血糖、MAU及肾组织E-cad、N-cad、FN、α-SMA表达方面,益肾方低、高剂量组与洛汀新组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。(2)mRNA转录组测序正常组比对模型组共发现293个差异基因,正常组比对益肾方治疗组共有101个差异基因,模型组比对益肾方治疗组共有10个差异基因;各组差异mRNA的GO分析主要富集在炎症反应、脂肪酸代谢、免疫反应相关条目,京都基因与基因组百科全书富集通路主要涉及PPAR信号通路、IL-17信号通路等。sRNA测序正常组比对模型组共6个差异miRNA,其他组未发现差异miRNA,GO富集条目有离子结合、细胞内溶质等,KEGG富集通路NF-κB、Hippo信号通路、细胞外基质受体作用通路。【结论】益肾方可有效改善糖尿病肾病小鼠的生化指标,减轻肾脏病理变化,其肾脏保护作用可能是通过激活PPAR信号通路,抑制IL-17、NF-κB信号通路,从而调节炎症反应、脂代谢、免疫反应来实现的。

Construction and biological characterization of Burkholderia pseudomallei sRNA gene deletion strain

Objective:Construction of Burkholderia pseudomallei(B.pseudomallei)sRNA knockout strains and observation of their biological function.Methods:Design 9sF/9sR,9xF/9xR and R1/F1 primers,which were used to amplify the homologous arm fragment upstream and downstream of the sRNA gene,through enzyme cutting,ligation,and transformation,the sRNA gene was knocked out from the B.pseudomallei by homologous recombination method.Results:The sRNA mutant was successfully constructed.In comparison with wild strain HNBP001,the growth rate,motility and biofilm formation ofΔsRNA decreased,but the antibiotic sensitivity has no differences.Conclusion:The sRNA knockout strain of B.pseudomallei was successfully constructed,laying a foundation for further research on its mechanism of regulating B.pseudomallei.

肠炎沙门氏菌sRNA伴侣蛋白Hfq表达与纯化

利用pET原核表达系统和亲和层析表达纯化肠炎沙门氏菌sRNA伴侣蛋白Hfq。首先构建含靶基因hfq的重组表达质粒pET28a(+)-hfq,经PCR及双酶切鉴定构建正确,再将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导目的基因高效表达。SDS-PAGE及Western blot结果表明:Hfq在大肠杆菌中成功表达,蛋白分子质量约为16.6ku,且主要存在于上清中,以可溶形式表达。进一步对表达产物进行Ni 2+亲和层析纯化,获得纯度较高的融合蛋白,为研究Hfq蛋白与sRNA的相互作用以及sRNA的调控机制提供基础。

细菌sRNA基因及其靶标预测研究进展

细菌sRNA是一类长度在40-500 nt之间的非编码RNA，主要以不完全碱基配对方式与靶标mRNA5′端相互作用进而发挥其生物学功能。鉴于预测方法可以为细菌sRNA及其靶标的实验发现提供指导，因此，细菌sRNA与靶标预测研究受到了广泛重视。文章首先将sRNA预测方法分为3类，分别是基于比较基因组学的预测方法、基于转录单元的预测方法和基于机器学习的预测方法；其次，将sRNA靶标预测方法分为2类，分别是序列比较方法与基于RNA二级结构的预测方法；最后对各类方法的原理、核心思想、优点和局限性进行了分析，并探讨了进一步的发展方向。

西方蜜蜂(Apis mellifera L．)sRNA的富集与文库检测

【目的】提取及扩增蜜蜂(Apis mellifera L)sRNA,并构建文库检测富集结果是否满足高通量测序研究要求。【方法】取蜜蜂3个级型不同发育阶段个体作为材料,分别提取总RNA后混合,从中分离出15～40nt的sRNA,反转成cDNA后构建文库,进行蓝白斑筛选。挑选288个单克隆进行测序,对测序结果进行分析。【结果】有效序列为214条,插入的cDNA片段大小范围为15～39bp。其中,sme-miR-71c miRNA65条,ncRNA(包括tm-RNA、intron_ghI、5.8s rRNA)5条,tRNA28条,siRNA及其他sRNA33条,CDS1条,未知序列82条。【结论】本实验采用的方法能有效富集蜜蜂sRNA,能够满足高通量测序从中识别出蜜蜂miRNA的研究。

伤寒沙门菌sRNA S2959增强细菌动力和生物膜形成能力

目的研究伤寒沙门菌小RNA(sRNA) S2959对细菌动力以及生物膜形成能力的影响。方法利用Red重组系统制备伤寒沙门菌sRNA S2959缺陷株(△S2959),同时制备sRNA S2959缺陷株的空载体株(△S2959-pBAD)和回补株(△S2959-p S2959)等相关菌株。通过sRNA S2959缺陷株和野生株的生长曲线实验观察sRNA S2959缺失后对细菌生长的影响;通过细菌sRNA S2959缺陷株、空载体株、回补株的泳动能力实验和生物膜实验观察sRNA S2959对细菌动力以及生物膜形成能力的影响;再用定量PCR(q PCR)方法检测细菌鞭毛相关基因在sRNA S2959相关菌株中的表达水平。结果成功制备sRNA S2959缺陷株和回补株; sRNA S2959缺陷株和野生株在LB和TSB液体培养基中的生长曲线无明显差异;与野生株相比,sRNA S2959缺陷株的泳动能力和生物膜形成能力下调(P<0.05),而回补株的泳动能力和生物膜形成能力较缺陷株显著增加(P<0.05); q PCR结果显示,高表达sRNA S2959后,细菌鞭毛相关基因(flh D、fli A和flj B)的mRNA水平分别上调大约4、3和6倍。结论伤寒沙门菌sRNA S2959促进鞭毛的表达,进一步上调伤寒沙门菌动力以及生物膜的形成能力。

木薯sRNA测序分析及其开花相关microRNA的挖掘

为研究木薯花序与叶片中sRNA表达特性,探索microRNA对其开花过程的调控。本研究以木薯品种"华南八号"花序和幼叶为材料,利用RNA-seq技术进行sRNA测序分析;并筛选开花相关microRNAs进行表达特性分析。从花序和幼叶测序结果中分别获得12 092 109条和11 499 655条sRNA序列。花序中筛选出139条已知microRNAs和253条新预测microRNA,分别预测得到992和3736条靶基因;幼叶中筛选出134条已知microRNA和191条新预测microRNAs,分别预测得到979和2 603条靶基因。最终筛选出8种与开花调控相关和3种花色调控相关的microRNAs。表达分析显示,miRNAs在两样品间呈现出较大的整体性差异,并且在功能与代谢通路上也不尽相同;开花相关microRNAs中表达差异较大的为miR156、miR172和miR169,其中miR156表达量在花序中高于幼叶,而miR172表达量在花序中低于幼叶,推测其功能为抑制后续的开花过程,避免过度开花。本研究分析了木薯花序与幼叶中sRNA的整体特性,通过表达差异分析初步明确了microRNAs对木薯开花的调控,为进一步深入探索奠定了基础。

sRNA STnc1220基因缺失株对鼠伤寒沙门菌生物学特性和致病力的影响

为探究鼠伤寒沙门菌sRNA STnc1220的分子特征、生物学功能及对细菌毒力的影响,通过PCR扩增了鼠伤寒沙门菌sRNA STnc1220基因,分析了其分子特征,利用TargetRNA2网站预测STnc1220基因可能调控的靶基因;利用λ-Red同源重组技术构建沙门菌(STM)-基因缺失突变株,并与亲本SL1344比较,对其生长特性、生化特性、遗传稳定性、生物被膜(BF)形成能力、在不同应激环境中(pH值、H_(2)O_(2)、高盐和乙醇胁迫环境)的适应性、通过黏附侵染巨噬细胞和小鼠感染试验对致病力进行研究。结果显示,STnc1220基因全长73 bp、其上游5′-UTR存在-10和-35启动子结合位点,预测其潜在的靶基因为barA基因;试验成功构建缺失株STM-ΔSTnc1220,且具有良好的遗传稳定性;与SL1344亲本株相比,缺失株的生长速度、生化特性及生物被膜形成能力没有发生改变;在pH=4.8,pH=9和H_(2)O_(2)条件下生长速率差异不显著,但在4%NaCl环境下,缺失株在7 h后生长速率明显高于亲本株,在3.8%乙醇环境中缺失株在对数期的生长速率显著升高(P<0.05);其对巨噬细胞中黏附和侵袭能力极显著降低(P<0.01),小鼠LD_(50)显著升高,对小鼠的肝脏和脾脏的病理损伤致病力减弱。表明STnc1220基因在环境适应性和毒力调控中发挥了重要的作用。为阐明鼠伤寒沙门菌的致病机制提供理论依据。

空气-SRNA-4催化剂磁流化床动力学研究

在内径和高分别为140mm和1600 mm气固磁流化床反应器内,分别以空气和SRNA-4催化剂(平均粒径50μm)为气相和固相,采用不同外加磁场强度对磁流化床动力学进行了研究。应用计算流体力学软件FLUENT 6.2对磁流化床内局部固含率和床层压降进行了模拟计算。模拟结果显示:无磁场作用时,随表观气速增加,床层界面变化剧烈,床内局部固含率的分布极不均匀,床层压降升高。随着磁场强度增加,气泡的数目和尺寸减小,床中局部固含率增大,且分布变得较均匀,床层压降呈现下降趋势。模拟结果与实验数据吻合良好。

常规培养与缺氧条件下BCG菌体内外sRNA的表达检测

近期发现细菌的sRNA在菌体内和菌体外均具有一定的生物学功能。为研究结核分枝杆菌菌体内外sRNA的表达情况,通过分析卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin Vaccine,BCG)菌体和外泌体RNA测序结果,采用RT-qPCR法检测常规培养与缺氧条件下BCG菌体内外sRNA相对表达量,分析菌体内外sRNA谱的差异。结果显示,常规培养时,菌体内丰度较高的sRNA为MTS2823、MTS1338与ASdes,菌体外丰度较高的为Mcr3、MTS2823和AS1890。菌体内受缺氧诱导表达增加的是MTS2823、MTS1338、MTS0997和G2。其中MTS1338与G2的启动子区发现了DosR的结合基序。无论是否缺氧,MTS0997、G2、Mcr7和AS1890在菌体外的相对表达量均高于菌体内,而C8只在缺氧时菌体外表达增高。研究揭示了BCG菌体内外sRNA表达谱不同,且一部分sRNA在常规培养和缺氧应激时向菌体外释放,同时发现了细菌受缺氧诱导的sRNA种类。

布鲁菌sRNA研究进展

布鲁菌病是一种危害严重的人兽共患病,威胁着畜牧业的发展和人类的公共卫生安全。作为布鲁菌病的病原,布鲁菌能够耐受宿主体内的各种杀菌机制并持续的生存。细菌的sRNA在基因组中被转录,但绝大多数sRNA并不编码蛋白质。sRNA通过碱基配对与mRNA结合,影响mRNA的稳定性或翻译,从而调控细菌代谢、群体感应、环境应激及细菌毒力基因表达等生物过程。通过sRNA调控毒力相关基因表达,使布鲁菌可以耐受多种胞内应激环境。目前为止,仅有少数布鲁菌sRNA的功能得到了较全面的研究,论文对这些sRNA的研究进展进行综述。

NRSE/RE-1 dsRNA诱导小鼠胚胎干细胞分化为NSE阳性的神经元样细胞

应用电打孔的方法将化学合成的NRSE/RE-1d sRNA转染小鼠胚胎干细胞,在去除LIF的条件下,直接接种培养,观察其分化情况,并对分化结果进行相关检测.结果显示分化细胞呈明显的神经样改变,免疫荧光显示NSE阳性率为(82.3±8.1)%.说明通过转染NRSE/RE-1d sRNA能有效地诱导小鼠胚胎干细胞向神经元细胞分化.