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sTNFRII-gAD-Fc融合蛋白在CHO细胞中的高效表达
1
作者
王彩虹
柳英
+3 位作者
蔡秦真
杨红枚
马丽莎
高基民
《免疫学研究》
2015年第1期1-11,共11页
构建了人肿瘤坏死因子受体II胞外区、人脂联素球部与人IgG1 Fc的融合基因sTNFRII-gAD-Fc的真核表达载体,在CHO-S细胞中快速高效表达,探索了无血清悬浮流加培养工艺。应用重组PCR将人IgG1 Fc基因片段与sTNFRII-gAD基因片段融合,构建pMH3-...
构建了人肿瘤坏死因子受体II胞外区、人脂联素球部与人IgG1 Fc的融合基因sTNFRII-gAD-Fc的真核表达载体,在CHO-S细胞中快速高效表达,探索了无血清悬浮流加培养工艺。应用重组PCR将人IgG1 Fc基因片段与sTNFRII-gAD基因片段融合,构建pMH3-sTNFRII-gAD-Fc表达载体,电转染至CHO-S细胞,挑选G418抗性的高表达单克隆,斑点杂交半定量分析和Western blot分析sTNFRII-gAD-Fc的表达,Protein A-Agarose纯化,以及拮抗TNFα的生物活性测定。最后在摇瓶、转瓶及生物反应器中进行了逐级放大的无血清悬浮批次及流加培养,即:2.0 ×106 cells/mL的接种密度,当达到4.0 ×106 cells/mL以上时开始流加培养并以每日葡萄糖的残余量2 g/L左右作为流加体积的控制参数。成功构建pMH3- sTNFRII-gAD-Fc表达载体,检测到sTNFRII-gAD-Fc在CHO-S细胞培养上清中以二聚体和多聚体形式表达,获得了高表达(75 μg/mL)单克隆细胞株,且该蛋白具有显著抑制TNFα杀伤L929细胞的活性。在摇瓶中无血清批次培养和转瓶及生物反应器中流加培养时产量分别为10.0 mg/L、18.3 mg/L和20.5 mg/L。利用CHO-S细胞系统成功实现了sTNFRII-gAD-Fc 融合蛋白的快速高效表达,为建立一套高密度、高效表达该融合蛋白的悬浮流加培养中试工艺打下了良好基础。
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关键词
可溶性肿瘤坏死因子受体II-脂联素球部
人免疫球蛋白G1
Fc
TNF拮抗剂
“富含GC”表达体系
悬浮流加培养
下载PDF
职称材料
腺病毒载体介导的重组蛋白sTNFRII-gAD快速表达和制备
被引量:
3
2
作者
陆月
刘丹
+7 位作者
张孝任
刘雪荣
沈炜
郑刚
柳云帆
董小岩
吴小兵
高基民
《生物工程学报》
CAS
CSCD
北大核心
2011年第8期1239-1246,共8页
利用腺病毒载体高效感染哺乳动物细胞及表达外源基因的特性,建立一种快速高效表达及制备重组蛋白的方法,并用该方法获得sTNFRII-gAD(可溶性肿瘤坏死因子受体II-脂联素球部融合蛋白)蛋白纯品。首先用携带EGFP基因的腺病毒载体rAd5-EGF...
利用腺病毒载体高效感染哺乳动物细胞及表达外源基因的特性,建立一种快速高效表达及制备重组蛋白的方法,并用该方法获得sTNFRII-gAD(可溶性肿瘤坏死因子受体II-脂联素球部融合蛋白)蛋白纯品。首先用携带EGFP基因的腺病毒载体rAd5-EGFP以不同的腺病毒用量(MOI)(0-1 000)感染BHK21c022细胞,观察比较其转导效率和细胞毒性。用AdMax腺病毒载体系统制备携带融合基因sTNFRII-gAD的重组复制缺陷型5型腺病毒rAd5-sTNFRII-gAD。用rAd5-sTNFRII-gAD以不同的MOI(0~1 000)感染BHK21c022细胞,收取上清进行Western blotting分析,比较上清中sTNFRII-gAD蛋白的表达量。在此基础上,用rAd5-sTNFRII-gAD以MOI 100感染大量培养的BHK21c022细胞,在无血清培养条件下反复多次收取培养上清,经过硫酸铵浓缩、分子筛柱层析、透析等步骤浓缩和纯化sTNFRII-gAD融合蛋白,并体外测定该融合蛋白拮抗TNFα的活性。结果获得了携带sTNFRII-gAD融合基因的重组腺病毒rAd5-sTNFRII-gAD;用rAd5-EGFP感染BHK21c022细胞结果表明,随着腺病毒用量的增高,表达EGFP蛋白的BHK21c022细胞数量和亮度明显增加;MOI在0~100之间被感染的BHK21c022细胞未表现出明显的细胞毒性,MOI为1 000时可观察到细胞变圆和少量死亡现象。Western blotting分析结果表明,随着腺病毒用量的增高,培养上清中sTNFRII-gAD融合蛋白表达量明显增加,以MOI为1 000时最高。在此基础上,我们用MOI为100的rAd5-sTNFRII-gAD感染5个转瓶培养的BHK21c022细胞以制备sTNFRII-gAD融合蛋白。每个转瓶加无血清培养液100 mL,每48 h收获上清1次并换液,反复6次收取培养上清共约3 L,经过纯化获得了约11 mg的sTNFRII-gAD融合蛋白。体外活性测定实验表明,获得的sTNFRII-gAD融合蛋白能有效拮抗TNFα对L929细胞的杀伤作用。腺病毒载体/BHK21细胞表达系统是一个简便、高效、通用的表达系统,利用该系统成功制备了有生物学活性的sTNFRII-gAD融合蛋白。该表达系统的特点是生产规模易于放大,适应无血清培养,可以反复多次收获目标蛋白。
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关键词
腺病毒
重组蛋白
BHK21细胞
哺乳动物细胞
stnfrii-gad
原文传递
制备可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ-脂联素球部融合蛋白的两种细胞培养工艺比较
3
作者
黄世高
尹玉婷
+3 位作者
熊春晖
王彩虹
吕建新
高基民
《生物工程学报》
CAS
CSCD
北大核心
2013年第1期115-118,共4页
利用7.5L生物反应器篮式贴壁培养和全悬浮批式培养CHO工程细胞株表达可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ-脂联素球部(sTNFRII-gAD)融合蛋白,比较这两种培养方法的产率,以便优化高效表达sTNFRII—gAD融合蛋白的制备工艺。篮式贴壁培养首先小...
利用7.5L生物反应器篮式贴壁培养和全悬浮批式培养CHO工程细胞株表达可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ-脂联素球部(sTNFRII-gAD)融合蛋白,比较这两种培养方法的产率,以便优化高效表达sTNFRII—gAD融合蛋白的制备工艺。篮式贴壁培养首先小规模培养CHO工程细胞株,待细胞增殖到一定密度后以3×105-4×10^5cells/mL密度接种生物反应器贴壁培养3d,调换成不含血清的LK021培养基继续培养4d。而全悬浮无血清批式培养则以3×10^5-4×10^5cells/mL密度的CHO工程细胞株接种于生物反应器,连续培养7d。培养过程实时监测培养条件,维持pH和DO的稳定。分别收集细胞上清,离心去细胞后用Pellicon切相流超滤系统对蛋白进行浓缩,并通过DEAE离子交换柱进行纯化。结果显示,篮式贴壁培养和全悬浮批式培养均成功表达了sTNFRII-gAD融合蛋白,产量分别为8.0mg/L和7.5mg/L、纯度分别为95%和98%,从而为sTNFRII-gAD融合蛋白的中试工艺研究提供了一定的基础。
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关键词
可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ-脂联素球部融合蛋白
生物反应器
CHO细胞
真核表达
原文传递
题名
sTNFRII-gAD-Fc融合蛋白在CHO细胞中的高效表达
1
作者
王彩虹
柳英
蔡秦真
杨红枚
马丽莎
高基民
机构
温州医科大学检验医学院、生命科学学院浙江省模式生物技术与应用重点实验室
烟台市龙口矿务局中心医院ICU
出处
《免疫学研究》
2015年第1期1-11,共11页
基金
国家新药创新重大专项(No.2009ZX09103-649)
浙江省重大科技专项(Nos.2008C14082,2010C13007)
+3 种基金
卫生部科研基金(No.201231029)
浙江省教育厅科学基金(No.Y201016528)
浙江省卫生高层次创新人才培养工程
浙江省研究生创新科研项目。
文摘
构建了人肿瘤坏死因子受体II胞外区、人脂联素球部与人IgG1 Fc的融合基因sTNFRII-gAD-Fc的真核表达载体,在CHO-S细胞中快速高效表达,探索了无血清悬浮流加培养工艺。应用重组PCR将人IgG1 Fc基因片段与sTNFRII-gAD基因片段融合,构建pMH3-sTNFRII-gAD-Fc表达载体,电转染至CHO-S细胞,挑选G418抗性的高表达单克隆,斑点杂交半定量分析和Western blot分析sTNFRII-gAD-Fc的表达,Protein A-Agarose纯化,以及拮抗TNFα的生物活性测定。最后在摇瓶、转瓶及生物反应器中进行了逐级放大的无血清悬浮批次及流加培养,即:2.0 ×106 cells/mL的接种密度,当达到4.0 ×106 cells/mL以上时开始流加培养并以每日葡萄糖的残余量2 g/L左右作为流加体积的控制参数。成功构建pMH3- sTNFRII-gAD-Fc表达载体,检测到sTNFRII-gAD-Fc在CHO-S细胞培养上清中以二聚体和多聚体形式表达,获得了高表达(75 μg/mL)单克隆细胞株,且该蛋白具有显著抑制TNFα杀伤L929细胞的活性。在摇瓶中无血清批次培养和转瓶及生物反应器中流加培养时产量分别为10.0 mg/L、18.3 mg/L和20.5 mg/L。利用CHO-S细胞系统成功实现了sTNFRII-gAD-Fc 融合蛋白的快速高效表达,为建立一套高密度、高效表达该融合蛋白的悬浮流加培养中试工艺打下了良好基础。
关键词
可溶性肿瘤坏死因子受体II-脂联素球部
人免疫球蛋白G1
Fc
TNF拮抗剂
“富含GC”表达体系
悬浮流加培养
Keywords
stnfrii-gad
IgG1 Fc
TNF Antagonist
GC-Rich Expression System
Suspension Fed-Batch Culture
分类号
Q7 [生物学—分子生物学]
下载PDF
职称材料
题名
腺病毒载体介导的重组蛋白sTNFRII-gAD快速表达和制备
被引量:
3
2
作者
陆月
刘丹
张孝任
刘雪荣
沈炜
郑刚
柳云帆
董小岩
吴小兵
高基民
机构
温州医学院浙江省模式生物技术与应用重点实验室
中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所病毒基因工程国家重点实验室
北京五加和分子医学研究有限公司
出处
《生物工程学报》
CAS
CSCD
北大核心
2011年第8期1239-1246,共8页
基金
国家新药创新重大专项(No.2009ZX09103-649)
国家传染病重大专项(No.2008ZX10001-012)
+5 种基金
浙江省重大科技专项(No.2008C14082)
浙江省自然科学基金(No.R2080407)
浙江省卫生高层次创新人才培养工程
温州市科技计划(No.G20090142)
病毒基因工程国家重点实验室开放课题
浙江省新苗计划(No.2009R413042)资助~~
文摘
利用腺病毒载体高效感染哺乳动物细胞及表达外源基因的特性,建立一种快速高效表达及制备重组蛋白的方法,并用该方法获得sTNFRII-gAD(可溶性肿瘤坏死因子受体II-脂联素球部融合蛋白)蛋白纯品。首先用携带EGFP基因的腺病毒载体rAd5-EGFP以不同的腺病毒用量(MOI)(0-1 000)感染BHK21c022细胞,观察比较其转导效率和细胞毒性。用AdMax腺病毒载体系统制备携带融合基因sTNFRII-gAD的重组复制缺陷型5型腺病毒rAd5-sTNFRII-gAD。用rAd5-sTNFRII-gAD以不同的MOI(0~1 000)感染BHK21c022细胞,收取上清进行Western blotting分析,比较上清中sTNFRII-gAD蛋白的表达量。在此基础上,用rAd5-sTNFRII-gAD以MOI 100感染大量培养的BHK21c022细胞,在无血清培养条件下反复多次收取培养上清,经过硫酸铵浓缩、分子筛柱层析、透析等步骤浓缩和纯化sTNFRII-gAD融合蛋白,并体外测定该融合蛋白拮抗TNFα的活性。结果获得了携带sTNFRII-gAD融合基因的重组腺病毒rAd5-sTNFRII-gAD;用rAd5-EGFP感染BHK21c022细胞结果表明,随着腺病毒用量的增高,表达EGFP蛋白的BHK21c022细胞数量和亮度明显增加;MOI在0~100之间被感染的BHK21c022细胞未表现出明显的细胞毒性,MOI为1 000时可观察到细胞变圆和少量死亡现象。Western blotting分析结果表明,随着腺病毒用量的增高,培养上清中sTNFRII-gAD融合蛋白表达量明显增加,以MOI为1 000时最高。在此基础上,我们用MOI为100的rAd5-sTNFRII-gAD感染5个转瓶培养的BHK21c022细胞以制备sTNFRII-gAD融合蛋白。每个转瓶加无血清培养液100 mL,每48 h收获上清1次并换液,反复6次收取培养上清共约3 L,经过纯化获得了约11 mg的sTNFRII-gAD融合蛋白。体外活性测定实验表明,获得的sTNFRII-gAD融合蛋白能有效拮抗TNFα对L929细胞的杀伤作用。腺病毒载体/BHK21细胞表达系统是一个简便、高效、通用的表达系统,利用该系统成功制备了有生物学活性的sTNFRII-gAD融合蛋白。该表达系统的特点是生产规模易于放大,适应无血清培养,可以反复多次收获目标蛋白。
关键词
腺病毒
重组蛋白
BHK21细胞
哺乳动物细胞
stnfrii-gad
Keywords
adenovirus
recombinant proteins
BHK21 cells
mammalian cells
stnfrii-gad
分类号
Q78 [生物学—分子生物学]
原文传递
题名
制备可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ-脂联素球部融合蛋白的两种细胞培养工艺比较
3
作者
黄世高
尹玉婷
熊春晖
王彩虹
吕建新
高基民
机构
温州医学院浙江省模式生物技术与应用重点实验室
出处
《生物工程学报》
CAS
CSCD
北大核心
2013年第1期115-118,共4页
基金
国家新药创新重大专项(No.2009ZX09103-649)
浙江省重大科技专项(Nos.2008C14082
+4 种基金
2010C13007)
卫生部科研基金(No.201231029)
浙江省教育厅科学基金(No.Y201016528)
浙江省卫生高层次创新人才培养工程
浙江省研究生创新科研项目资助~~
文摘
利用7.5L生物反应器篮式贴壁培养和全悬浮批式培养CHO工程细胞株表达可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ-脂联素球部(sTNFRII-gAD)融合蛋白,比较这两种培养方法的产率,以便优化高效表达sTNFRII—gAD融合蛋白的制备工艺。篮式贴壁培养首先小规模培养CHO工程细胞株,待细胞增殖到一定密度后以3×105-4×10^5cells/mL密度接种生物反应器贴壁培养3d,调换成不含血清的LK021培养基继续培养4d。而全悬浮无血清批式培养则以3×10^5-4×10^5cells/mL密度的CHO工程细胞株接种于生物反应器,连续培养7d。培养过程实时监测培养条件,维持pH和DO的稳定。分别收集细胞上清,离心去细胞后用Pellicon切相流超滤系统对蛋白进行浓缩,并通过DEAE离子交换柱进行纯化。结果显示,篮式贴壁培养和全悬浮批式培养均成功表达了sTNFRII-gAD融合蛋白,产量分别为8.0mg/L和7.5mg/L、纯度分别为95%和98%,从而为sTNFRII-gAD融合蛋白的中试工艺研究提供了一定的基础。
关键词
可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ-脂联素球部融合蛋白
生物反应器
CHO细胞
真核表达
Keywords
stnfrii-gad
fusion protein, bioreactor, CHO cells, eukaryotic expression
分类号
R730.5 [医药卫生—肿瘤]
原文传递
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
sTNFRII-gAD-Fc融合蛋白在CHO细胞中的高效表达
王彩虹
柳英
蔡秦真
杨红枚
马丽莎
高基民
《免疫学研究》
2015
0
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职称材料
2
腺病毒载体介导的重组蛋白sTNFRII-gAD快速表达和制备
陆月
刘丹
张孝任
刘雪荣
沈炜
郑刚
柳云帆
董小岩
吴小兵
高基民
《生物工程学报》
CAS
CSCD
北大核心
2011
3
原文传递
3
制备可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ-脂联素球部融合蛋白的两种细胞培养工艺比较
黄世高
尹玉婷
熊春晖
王彩虹
吕建新
高基民
《生物工程学报》
CAS
CSCD
北大核心
2013
0
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