肠炎沙门氏菌非编码小RNA STnc640对菌毛相关基因的调控分析

STnc640是一种功能未知的沙门氏菌非编码小RNA(sRNA),为研究其对肠炎沙门氏菌(SE)菌毛相关基因的调控作用,本研究通过λ噬菌体Red同源重组系统构建了SE50336株stnc640缺失突变株(50336△stnc640),并利用表达载体p BR322构建了回补株50336△stnc640/pstnc640。利用荧光定量RT-PCR(q RT-PCR)检测STnc640在SE50336株不同生长时期的转录水平,结果显示,细菌生长的稳定后期STnc640转录水平最高,为对数生长早期表达量的16.5倍;同时检测主要菌毛亚单位sefA、safA、stbA、sthA、csgA、csgD、peg 和外膜蛋白基因ompD的表达,结果显示,相比亲本株50336,50336△stnc640中sef A、csgD和ompD基因的表达均显著下调,而50336△stnc640/pstnc640回补株中以上各基因的表达均得到恢复。本实验结果表明STnc640对SE部分菌毛基因的表达具有调控作用。

sRNA STnc440分子特征及对鼠伤寒沙门菌毒力的影响

【目的】探究鼠伤寒沙门菌(STM)sRNA STnc440的分子特征及对细菌毒力的影响,为进一步揭示STnc440的调控机制奠定基础。【方法】克隆STnc440基因序列并进行分子特征分析,采用λ-Red重组技术构建了STnc440缺失株△STnc440和回补株△STnc440/STnc440,通过细胞侵染和小鼠感染试验研究STnc440对STM毒力的影响,预测分析STnc440调控的靶基因。【结果】sRNA STnc440基因大小为81 bp,上游序列含有-10 box和-35 box启动子核心区域,遗传进化分析表明该基因在沙门菌属中相对保守。与STM亲本株和回补株相比,缺失株△STnc440在生长特性上无明显差异,对巨噬细胞的粘附能力和侵袭力显著减弱,LD50显著升高,在小鼠肝脏和脾脏中的定殖能力均显著降低(P<0.05)。靶基因预测分析发现,STnc440的靶基因可能为SL1344_2880(Ⅰ型毒力岛蛋白)。【结论】sRNA STnc440对STM毒力有一定的调控作用,可能通过调控SL1344_2880来实现。

sRNA STnc1220基因缺失株对鼠伤寒沙门菌生物学特性和致病力的影响

为探究鼠伤寒沙门菌sRNA STnc1220的分子特征、生物学功能及对细菌毒力的影响,通过PCR扩增了鼠伤寒沙门菌sRNA STnc1220基因,分析了其分子特征,利用TargetRNA2网站预测STnc1220基因可能调控的靶基因;利用λ-Red同源重组技术构建沙门菌(STM)-基因缺失突变株,并与亲本SL1344比较,对其生长特性、生化特性、遗传稳定性、生物被膜(BF)形成能力、在不同应激环境中(pH值、H_(2)O_(2)、高盐和乙醇胁迫环境)的适应性、通过黏附侵染巨噬细胞和小鼠感染试验对致病力进行研究。结果显示,STnc1220基因全长73 bp、其上游5′-UTR存在-10和-35启动子结合位点,预测其潜在的靶基因为barA基因;试验成功构建缺失株STM-ΔSTnc1220,且具有良好的遗传稳定性;与SL1344亲本株相比,缺失株的生长速度、生化特性及生物被膜形成能力没有发生改变;在pH=4.8,pH=9和H_(2)O_(2)条件下生长速率差异不显著,但在4%NaCl环境下,缺失株在7 h后生长速率明显高于亲本株,在3.8%乙醇环境中缺失株在对数期的生长速率显著升高(P<0.05);其对巨噬细胞中黏附和侵袭能力极显著降低(P<0.01),小鼠LD_(50)显著升高,对小鼠的肝脏和脾脏的病理损伤致病力减弱。表明STnc1220基因在环境适应性和毒力调控中发挥了重要的作用。为阐明鼠伤寒沙门菌的致病机制提供理论依据。

sRNA STnc290对鼠伤寒沙门菌侵染细胞及致病力的影响

【目的】鼠伤寒沙门菌(STM)是一种可感染人和多种动物的重要人兽共患病原菌,故有必要研究STM小RNA(sRNA)STnc290基因的分子特征和在细菌的细胞侵染及小鼠致病性中的作用。【方法】通过PCR扩增STM sRNA STnc290基因,并利用生物信息学软件分析STnc290基因的序列特征、二级结构分子特征及预测潜在靶基因。同时,利用λ-Red同源重组系统构建STnc290基因缺失株及回补株;通过分析STM-SL1344、STM-ΔSTnc290及ΔSTnc290/STnc290在侵染细胞、小鼠半数致死剂量、小鼠存活率、致病小鼠肝脾载菌量和小鼠肝脾病理变化差异,利用qRT-PCR检测STnc290基因调控的潜在靶基因转录水平。【结果】sRNA STnc290基因大小为79 bp,其上游序列含有-10 box和-35 box的启动子核心序列TGATATATA和CTGACA,并且还存在σ因子rpoD16结合位点AAATAATT;STnc290基因的二级结构含有典型的茎环结构;通过在线软件预测发现STnc290基因2个潜在的靶基因为pqaA和narX基因。STM-SL1344、STM-ΔSTnc290及ΔSTnc290/STnc290菌株生长测定显示,与STM-SL1344和ΔSTnc290/STnc290回补株相比,STnc290基因缺失株在生长特性上无明显差异(P>0.05);与STM-SL1344株相比,STM-ΔSTnc290对小鼠巨噬细胞RAW264.7的黏附、侵袭能力均显著减弱(P<0.05);STM-ΔSTnc290株感染小鼠半数致死剂量显著升高(P<0.05);STM-ΔSTnc290株感染的小鼠存活率显著高于亲本株(P<0.05);STM-ΔSTnc290株感染小鼠肝脾载菌量在感染后第7、9天显著降低(P<0.05)。qRT-PCR检测表明,STnc290基因缺失株靶基因pqaA和narX转录水平均显著下调(P<0.05)。【结论】sRNA STnc290对STM侵染细胞及小鼠致病性具有重要的调控作用。

肌钙蛋白Ⅰ提取纯化新方法的研究

兔骨骼肌匀浆液经离心后，依次经DEAE－Sephadex A25，Sephadex G75及Butyl Sepharose F．F柱层析，得到了兔骨骼肌肌钙蛋白C（sTnC）纯品．将其与Sepharose 4B凝胶偶联，制成sTnC亲和层析凝胶．人心肌或骨骼肌经匀浆、离心后上sTnC亲和层析柱，一步分离可获得人心肌肌钙蛋白Ⅰ（cTn I）或人骨骼肌肌钙蛋白Ⅰ（sTn I）纯品．HPLC分析出现单一峰．SDS－PAGE分析得到一条电泳带，其分子量分别为25 000及 21 000．用 20 g sTnC亲和凝胶处理 40 g人心肌时，相当于每 100 g心肌可得到 82.6 mg cTnI.