油茶CoSAD基因载体的构建、鉴定及功能分析

为揭示油茶(Camellia oleifera Abel)硬脂酰-ACP脱饱和酶(SAD)基因(即Co SAD基因)的功能,构建了该基因的原核表达载体p ET28b-Co SAD、植物表达载体p BI121-Co SAD和RNA干扰载体p BI121-Co SAD RNAi,并采用PCR扩增及双酶切方法对3类载体进行鉴定;在此基础上,对原核表达载体中的Co SAD基因进行诱导表达分析,并对p BI121-Co SAD转化的拟南芥〔Arabidopsis thaliana(Linn.)Heynh.〕sad突变体植株和p BI121-Co SAD RNAi转化的拟南芥野生型植株进行转基因鉴定和主要脂肪酸成分含量分析。PCR扩增和双酶切结果显示:从p ET28b-Co SAD、p BI121-Co SAD和p BI121-Co SAD RNAi载体的阳性克隆中均可获得目的条带,表明这3类载体均构建成功;用1 mmol·L-1IPTG分别诱导0.5、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 h,Co SAD基因均能够在p ET28b-Co SAD转化的大肠杆菌BL21感受态细胞中正常表达,能够获得与预测结果相符的相对分子质量约47 000的特异目的蛋白条带,且蛋白活性随诱导时间的延长而升高。从p BI121-Co SAD转化的拟南芥突变体植株和p BI121-Co SAD RNAi转化的拟南芥野生型植株中也均可扩增出目的条带。GC-MS分析结果显示:与拟南芥野生型植株相比,其突变体植株的硬脂酸和棕榈酸含量较高、油酸和棕榈油酸含量较低;但突变体植株经p BI121-Co SAD转化后,硬脂酸和棕榈酸含量降低而油酸和棕榈油酸含量提高;野生型植株经过p BI121-Co SAD RNAi转化后,硬脂酸和棕榈酸含量提高、油酸和棕榈油酸含量降低,表明p BI121-Co SAD转化能够促进拟南芥sad突变体植株体内饱和脂肪酸向不饱和脂肪酸转化,而p BI121-Co SAD RNAi转化对拟南芥SAD基因的表达有明显的抑制作用,这2种重组质粒均可影响拟南芥植株的脂肪酸含量。研究结果表明:油茶Co SAD基因具有调控饱和脂肪酸(硬脂酸和棕榈酸)向不饱和脂肪酸(油酸和棕榈油酸)转化的功能,对茶油的脂肪酸组成具有关键的调控作用。

木薯SAD基因片段的克隆及其序列分析

通过比较拟南芥和蓖麻的SAD基因同源区域,设计引物并以木薯基因组DNA为模板进行PCR扩增,得到长度为240 bp的基因片段,命名为木薯SAD。序列相似性检索结果表明,木薯SAD基因的核苷酸序列与基因库中登陆的大戟科植物蓖麻、千年桐的mRNA序列同源性达94%,与大豆、芝麻、葵花等油料作物的mRNA序列同源性分别达到87%、86%和82%;系统进化分析进一步表明,木薯SAD基因与大戟科植物蓖麻、麻疯树和千年桐的亲缘关系最近,该结果与传统分类学将木薯与蓖麻、千年桐和麻疯树归于大戟科的结论相符,而木薯SAD基因与芝麻、大豆、莲花、葵花等植物种仁不饱和脂肪酸含量较高的植物在进化上具有较高的保守性。

两个油菜品系的fad2和sad基因序列差异比较

以来源相同而油酸含量差异显著的两个甘蓝型油菜DH品系WH141和WH149为研究材料克隆了与油酸含量相关的两个关键基因fad2(脂肪酸脱氢酶基因)和sad(硬脂酰ACP脱氢酶基因),并对克隆序列多次测序,利用DNAman软件分析两个基因序列差异。结果表明:①以fad2基因序列中的6个连续变异碱基为依据可将该基因分为2类,AF型和AY型。两者均存在于WH141和WH149品系中。AF型序列内两品系共有3处有义突变,但两品系对应氨基酸的出现频率有明显差异,说明相应fad2基因的拷贝数在两品系中有较大差异。另外,在氨基酸序列中第241位疏水氨基酸F变异为极性氨基酸Y,可能对该基因的功能有较大影响。AY型序列内,除了单碱基变异外,还存在小片段的插入缺失。单碱基变异大部分对应翻译不同种类的氨基酸。片段的插入缺失导致多个读码框出现,比较后发现WH141和WH149有3个相同的读码框,而且在WH149中发现还有2个可能的fad2基因特异表达框。②对比两品系sad基因的外显子序列后发现,WH141和WH149存在14个位点的单碱基变异,且绝大部分变异位点编码的氨基酸发生了改变。

木薯MeSAD基因的电子克隆与生物信息学分析

Δ9-硬脂酰-ACP脱氢酶(stearoyl-acyl carrier protein delta 9-desaturase,SAD)是植物响应逆境胁迫的关键酶,在响应低温胁迫中发挥着重要的作用,克隆木薯(Manihot esculenta)SAD基因对抗寒机理及品种改良研究具有很大的理论意义和现实意义。本文以拟南芥(Arabidopsis thaliana)的SAD同源蛋白为探针,利用电子克隆技术,得到木薯SAD的cDNA,并对表达蛋白的一级至高级结构、结构域、基本理化性质及系统发育等进行生物信息学分析。结果表明,木薯SAD基因cDNA长度为1685 bp,开放阅读框(ORF)为176~1366 bp,编码396个氨基酸,主要包含α螺旋以及无规则卷曲序列。该蛋白主要定位在叶绿体基质内,包含酰基-ACP脱氢酶结构域,具有酸性和亲水性。系统进化分析显示,木薯与蓖麻(Ricinus communis)、巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)和麻疯树(Jatropha curcas)等植物亲缘进化关系非常相近。本研究结果可为MeSAD基因功能解析、木薯抗寒机理及耐低温品种改良等奠定基础。

油棕^(Δ)9硬脂酰-ACP脱氢酶EgSAD基因的克隆及表达分析

^(Δ)9硬脂酰-ACP脱氢酶(^(Δ)9 stearoyl-ACP dehydrogenase,SAD)是植物中重要的脂肪酸脱氢酶,在调控不饱和脂肪酸合成中发挥着重要作用。本研究以非洲油棕和杂交油棕为材料,在油棕果实油脂积累期,分别测定花后120、140、160 d 3个时期的脂肪酸组分;从油棕中克隆SAD基因,并对其理化性质、进化关系、启动子顺式作用元件进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR检测SAD在2个油棕品种果实成熟期的表达特征。结果表明:非洲油棕中总不饱和脂肪酸(棕榈酸和硬脂酸)比例(55.76%~60.27%)显著高于杂交油棕(37.2%~45.43%),杂交油棕中不饱和脂肪酸(油酸和亚油酸)比例(51.61%~56.92%)显著高于非洲油棕(35.54%~38.64%);鉴定了7个基因命名为:EgSAD1~EgSAD4和OeSAD1~OeSAD3;EgSAD基因编码的肽链平均为413个氨基酸,分子量为43.41~45.92 kDa,等电点为5.99~7.13,蛋白不稳定指数为44.07~53.25,总平均亲水性为-0.496~-0.405。OeSAD基因编码的肽链平均为405个氨基酸,分子量为44.94~49.39kDa,等电点为6.05~7.14,蛋白不稳定指数为43.44~44.61,总平均亲水性为-0.554~-0.489。多序列比对分析,油棕SAD基因氨基酸序列中存在典型SAD特征的保守组氨酸富集区:EENRHG和DEKRHE。在SAD的启动子上鉴定出植物激素响应、逆境胁迫响应、光响应和逆境响应顺式作用元件。EgSADs在油棕果实成熟过程中呈上调表达趋势,EgSAD1和EgSAD2在杂交油棕中表达量显著高于非洲油棕,OeSADs在杂交油棕果实花后140 d中表达量最高,在杂交油棕的3个时期中均呈现先升高后下降的趋势,且在花后120 d的表达量显著高于花后120 d和160 d。本研究结果为进一步研究SAD调控油棕不饱和脂肪酸合成的机制奠定基础。

甘蓝型油菜Δ9硬脂酰ACP脱氢酶(SAD)基因的克隆与表达分析

为改良甘蓝型油菜菜籽油脂肪酸的组分,根据拟南芥Δ9硬脂酰ACP脱氢酶（SAD）核酸序列特征,检索白菜全基因组SAD基因和cDNA的可能序列,通过同源序列法克隆获得6个甘蓝型油菜SAD基因。比对结果显示,这6个基因编码的氨基酸序列同源性达53.2%~96.3%。系统进化分析显示,甘蓝型油菜SAD基因与蓖麻、大豆、芝麻、向日葵等6个油料作物SAD基因的序列相似性很高,甘蓝型油菜与这些高等植物的SAD基因在进化上具有较高的保守性。对4个甘蓝型油菜SAD基因BnSAD1∶1、BnSAD2∶1、BnSAD2∶2和BnSAD2∶3进行了表达模式分析,发现它们在种子发育过程中表达,并且都在40d的种子中表达量达到最高值,推测这4个基因均参与了硬脂酰ACP（C18∶0-ACP）脱氢生成油酰基ACP（Δ9C18∶1-ACP）的过程,尤其是BnSAD2∶3可能为种子特异表达基因。

油棕^(Δ)9硬脂酰-ACP脱氢酶基因(SAD)鉴定及表达分析

9硬脂酰-ACP脱氢酶(SAD)是调控油棕果实不饱和脂肪酸合成和积累的关键酶,鉴定油棕EgSAD家族成员,对其理化性质及表达模式的分析对EgSAD的基因功能及调控机制研究提供信息。本研究在全基因组范围内鉴定获得4个EgSAD基因,EgSAD1定位在油棕2号染色体上,EgSAD2定位在7号染色体上,Eg SAD4定位在11号染色体上,Eg SAD1有2个外显子,EgSAD2~EgSAD4有3个外显子。4个油棕EgSAD蛋白均定位在细胞核,油棕EgSAD1~EgSAD4蛋白质大小分别为471、393、391和399 aa,EgSAD1和Eg SAD2的等电点分别为6.05、EgSAD3和EgSAD4的等电点分别为5.99和7.13,分子量分别为43.41、45.01、44.94和45.92 kD。EgSAD2在油棕中果皮的4个时间点均超高量表达,其余3个基因在各组织中只有微量表达或不表达,该结果为油棕Eg SAD基因调控不饱和脂肪酸合成的分子机理解析理论依据。

花生Δ~9-硬脂酰-ACP脱氢酶基因启动子的克隆及功能分析

Δ~9-硬脂酰-ACP脱氢酶（SAD）是决定植物体内饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸比值的关键酶。以花生品种豫花9326基因组DNA为模板,通过基因组步移技术,克隆到花生Δ~9-硬脂酰-ACP脱氢酶基因（Ah SAD）起始密码子ATG上游720 bp片段,利用5＇RACE方法获得了该基因的5＇UTR序列,通过序列比对确定720 bp片段为Ah SAD启动子区域。PLACE在线启动子预测分析表明,该序列具有真核生物启动子必需的核心元件TATA-box和CAAT-box,含有多个与光诱导和激素响应相关顺式序列元件。将Ah SAD启动子片段替换pBI121质粒中的CaMV35S启动子驱动下游GUS基因表达,构建植物表达载体pBI-PAh SAD。通过农杆菌介导法转化拟南芥和在花生不同组织中瞬时表达,利用GUS组织化学染色研究其表达特性。表明在拟南芥和花生受体中,AhSAD启动子主要调控下游基因在根、茎、叶片和子叶中表达,在花生的果针中也检测到GUS活性;拟南芥的茎生叶只有叶脉中具有GUS活性,而花生整个叶片中都具有GUS活性。

紫苏硬脂酰-ACP脱氢酶基因家族鉴定及表达分析

硬脂酰-ACP脱氢酶(SAD)催化硬脂酸脱氢生成油酸,是形成不饱和脂肪酸的关键酶。该研究从紫苏转录组数据库中筛选鉴定紫苏硬脂酰-ACP脱氢酶(PfSAD)家族基因,并进行生物信息学分析及保守功能域分析,用qRT-PCR技术检测PfSADs各成员在不同组织中的表达特性,以探讨PfSAD家族基因在调控种子脂肪酸组分中的作用,为紫苏脂肪酸组分的遗传改良提供基因元件。结果显示:(1)从该课题组前期自测的紫苏转录组数据库中共检测出6个PfSAD家族基因,其编码蛋白的氨基酸长度介于367~396 aa之间,均具有SAD的保守结构域和二铁中心,预测其基因编码蛋白均定位于叶绿体。(2)多序列比对结果显示,紫苏PfSADs蛋白序列与拟南芥、蓖麻及可可等植物的SAD蛋白序列相似性均在50%以上;系统进化分析显示,6个紫苏SAD蛋白被分为3个亚组,其中第一个亚组包含PfSAD1,第二亚组包含PfSAD2、PfSAD3,第三亚组包含PfSAD4、PfSAD5和PfSAD6。(3)实时荧光定量PCR分析发现,PfSADs各成员在‘晋紫苏1号’不同组织中的表达量差异显著,其中PfSAD1主要在叶中表达,PfSAD2、PfSAD3、PfSAD4和PfSAD5在种子中表达量较高,PfSAD6在花中具有显著表达优势。研究表明,PfSADs具有典型的保守基序及催化SAD的活性中心,其各成员在不同的组织中高表达,推测这6个基因均参与了硬脂酰ACP(C18∶0-ACP)脱氢生成油酰基ACP(Δ9C18∶1-ACP)的过程,在紫苏油脂合成代谢过程中发挥重要作用。

宜宾油樟RNA的提取及分析

通过对RNA提取方法的改进,从宜宾油樟中分离纯化出高质量的总RNA.琼脂糖凝胶电泳呈现出清楚的28S rRNA和18S rRNA两条带及一条5S rRNA带;OD260/OD280为1.95,OD260/OD230为3.91.用所得RNA,通过RT-PCR技术,克隆到单一的油樟SAD基因保守区.表明:所得RNA完整性好,无污染和降解,可进一步用于油樟的分子生物学研究.

油用亚麻可溶性糖、脂肪含量与硬脂酰-酰基载体蛋白脱氢酶基因表达相关性分析

为研究油用亚麻叶片、果球4个发育阶段硬脂酰-酰基载体蛋白脱氢酶基因(sad)表达水平与可溶性糖含量、脂肪含量之间的关系,以3个已知亚麻酸含量相对不同的油用亚麻品种为试验对象,应用q RTPCR技术对不同发育时期组织中sad基因的相对表达量与可溶性糖含量以及脂肪含量之间的关系进行分析。结果表明,在油用亚麻叶片和果球的不同发育阶段sad基因的表达模式符合正态分布,在品种和时期之间表达量差异明显。可溶性糖的含量在果球和叶片中差异明显,相关性分析结果显示,在sad基因表达量增加时,可溶性糖含量相对减少;脂肪含量与sad基因的表达量呈极显著正相关。油用亚麻中sad基因表达直接影响油用亚麻可溶性糖和脂肪含量,进而影响亚麻油的品质。