金华地区血小板献血者血小板基因的分型特点和基因库建设

目的研究金华地区血小板献血者人类白细胞抗原(HLA)-A、B位点和人类血小板抗原(HPA)-1~6、10、15、21位点的多态性分布特点并统计基因频率,初步建立起金华地区血小板基因库。方法对2020年1月至2021年2月金华市中心血站109名单采血小板献血者标本的HLA-A、B和HPA-1~6、10、15、21位点进行基因分型,计算基因频率,并与不同国家和地区进行比较,分析基因分布的差异性。结果109名金华地区血小板献血者共检出HLA-A位点等位基因14个,基因频率较高的等位基因分别是A*02、A*11、A*24、A*33;检出HLA-B位点等位基因24个,基因频率从高到低分别是B*40、B*15、B*46、B*58、B*55、B*39、B*13。金华地区的A*02、A*11、B*40、B*15、B*46等位基因的分布频率与西安、云南、河南、辽宁、淄博、广东等地相比,差异均有统计学意义(均P<0.05)。HLA-A、B位点基因分型结果均符合Hardy-Weinberg平衡(均P>0.05)。HPA-4a、10a呈单特异性,杂合度最高的基因型是HPA-3和HPA-15,经Hardy-Weinberg遗传平衡检验,发现金华地区HPA-1~3、6、15、21的基因频率符合遗传平衡法则,基因具备恒定性。金华地区与英国、美国相比,HPA-1、HPA-2、HPA-5、HPA-15基因频率差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论金华地区血小板基因库的建立有助于为血小板输注无效的患者提供HLA和HPA相对匹配的血小板制品,提高血小板输注效率。

腺病毒介导的人低氧诱导因子–1α治疗兔后肢缺血的安全性研究

目的:对腺病毒介导的人低氧诱导因子-1α(Ad-HIF-1α)治疗兔急性后肢缺血的安全性进行探讨。方法:(1)Ad-HIF-1α及腺病毒空载体(Ad-Blank)扩增、滴度测定。(2)建立兔急性后肢缺血模型,随机分为3组,每组6只,分别以Ad-HIF-1α(2.0×1010PFU)、Ad-Blank(2.0×1010PFU)和NS(0.5mL)肌注离断股动脉肌群,观察兔一般反应,术前及术后7、28d检查心电图和血常规、肝肾功能,术后28d处死动物行病理学检查。结果:(1)Ad-HIF-1α及Ad-Blank滴度分别达2.0×1013、1.5×1013Pfu/mL。(2)受试期兔一般情况好;3组兔血常规、肝肾功能指标在正常值范围,组间对比无显著差异(P>0.05);心电图正常;病理学检查未见癌细胞。结论:兔急性后肢缺血模型局部一次性转染2.0×1010PFU的Ad-HIF-1α,未见明显毒副反应;Ad-HIF-1α应用于兔是相对安全的。

短发夹RNA对人骨髓间充质干细胞生长增殖的影响

目的观察靶向人端粒酶逆转录酶(hTERT)的短发夹RNA(shRNA)对人骨髓间充质干细胞(hMSCs)生长增殖的影响。方法根据RNA干扰原理,利用构建的表达shRNA的靶向hTERTmRNA的真核表达质粒(shRNA1),非特异性的shRNA真核表达质粒(shRNA2),转染试剂和正常培养液处理细胞。24h后在共聚焦显微镜下检测荧光表达情况;24h、48h、72h用MTT法检测细胞增殖活性;48h后行HE染色、RT-PCR及端粒酶活性检测。结果(1)共聚焦显微镜下见shRNA1及shRNA2组有大量的细胞表达荧光。(2)相应时间点各组细胞生长增殖无明显差异。HE染色发现,同等培养条件下,各组细胞生长密度及形态无明显变化。(3)RT-PCR显示各组细胞均无hTERTmRNA的表达;端粒酶活性均为阴性表达。结论靶向hTERTmRNA的shRNA对正常hMSCs的生长增殖无明显影响,该方法对不表达hTERT的正常体细胞是安全的。

PAMAM-D对异种移植用外源基因转染猪精子细胞的安全性研究

目的研究应用PAMAM-D对异种移植用外源基因hDAF转染猪精子细胞的安全性。方法制备PAMAM-D/hDAFcDNA复合物,将PAMAM-D及复合物与处理后猪精子细胞共孵育,经精子质量检测工作站检测孵育后的精子活力和精子畸形率。结果经精子质量检测工作站检测,PAMAM-D和PAMAM-D/DNA复合物对猪精子细胞活力和精子细胞畸形率没有明显影响。结论 PAMAM-D及其复合物对猪精子细胞没有明显毒性,应用PAMAM-D制备异种移植用转基因动物是一种安全的方法。

中华人种基因安全保护战略研究

人种基因是一个国家和民族重要的遗传资源,中华人种基因安全保护问题更是关系到现实的国家安全、民族安全、人种安全和中华民族永续发展的长久战略问题。在借鉴别国成功经验的基础上,中华人种基因安全保护更要立足于我国基本实际和根本国情,需要从立法规制、机构设置、战略实施和政策落实等方面加以全面且深度的规划,建立国家中华人种基因安全保护委员会,制定中华人种基因安全保护法,全面谋划中华人种基因的继续开发产业战略。

重组人胰岛素原基因质粒在糖尿病鼠体内表达的安全性初步研究

目的初步研究重组人胰岛素原基因逆转录病毒载体质粒(RHPGP)在糖尿病大鼠体内的安全性。方法将三碘甲腺原氨酸(T3)和肝细胞生长因子(HGF)注射入糖尿病鼠体内后,导入RHIGP,检测血糖、血清谷丙转氨酶(ALT)、白蛋白(ALB)、肌酐(CRE)和尿素氮(BUN),进行24h饥饿试验以及组织病理学检测和逆转录病毒复制完整型病毒(RCR)的检测。结果实验组大鼠血糖明显下降,饥饿试验中未有低血糖事件发生;实验组动物的ALT、ALB、CRE和BUN与正常组大鼠无统计学差异;病理检测光镜下未见癌细胞及异形核细胞;未检测到野生型逆转录病毒。结论我们构建RHIGP体内表达实现了安全性调控;RHIGP应用于活体动物是安全的。

中国不同民族永生细胞库的建立和应用

人类遗传资源具有重要的生命科学和医学研究及应用价值,国际不同民族群体遗传多样性研究具有重要意义,中国不同民族在民族渊源、语言、地理环境、生活习俗乃至生理表型和疾病易感性等方面存在差异,为医学与健康研究提供丰富的遗传资源材料.EB病毒(Epstein-Barr Virus,EBV)转化的永生化B淋巴细胞为是保存人类遗传资源的一种主要方式“中国不同民族永生细胞库”历时二十多年,已经建成包括49个法定民族,90多个群体,6126人份的永生细胞株的样本库.作为重要的国家战略资源,中国不同民族永生细胞库及其来源的核酸为中国人群遗传结构特征、基因变异、表达和功能等研究和应用提供研究材料,展现在药物发现、疫苗、抗体和干细胞等领域的应用潜力,显著促进中国在人类遗传资源的国际交流与合作,并伴随着高通量测序和基因编辑等先进技术的发展,将为人类生命科学研究和临床转化应用提供更具广阔前景的工具和资源.

非法植入基因编辑胚胎罪的保护法益证成

非法植入基因编辑胚胎罪系《刑法修正案(十一)》增加,正确适用本罪的前提在于明确其保护的法益。生命权与健康权、人类尊严、基因安全与遗传安全、人类基因科学技术应用的伦理性和安全性均无法作为本罪的保护法益,其对构成要件的解释无法起到具体规制机能。结合本罪的体系定位和构成要件行为,本罪应具有双层保护法益,表层法益体现为公共卫生管理秩序,深层法益体现为人类自然生殖利益。基于这一双层法益可以明确非法植入基因编辑胚胎罪的性质与具体构成要件要素的本质,并且能够说明立法者未对特定基因编辑行为犯罪化的原因,因而具有合理性。

非法植入基因编辑、克隆胚胎罪的保护法益:基于生命伦理的视角

作为一项新兴的生命科技,人体生殖系基因编辑可以改善个体和社会的境况,符合福利最大化原则。但这一技术远未成熟,贸然推广应用必将带来极大的不确定性风险,可能损害未来的人的健康等权益。对此,主流的伦理观认为,人体生殖系基因编辑的临床应用缺乏伦理正当性,但纯粹的不以生育为目的的医学实验在伦理上应被允许。法律是最低限度的伦理,刑法之所以禁止基因编辑“造人”的行为,是因为这一行为违反了相关的伦理规范。立足于目前的生命伦理规范,非法植入基因编辑、克隆胚胎罪的保护法益应是公共卫生秩序,而非人类基因库安全。因此,本罪是行政犯,以行为违反行政法规、行业规范等前置性规范为必要要件。

C57-ras转基因小鼠模型的建立

目的:建立用于临床前药物安全性致癌评价的人类原癌基因c-Ha-ras转基因小鼠模型。方法:通过PCR方法克隆人的原癌基因c-Ha-ras,全长6.5 kb,含有4个外显子,以及该基因本身的启动子、调控序列和poly A信号序列;并将其通过原核注射注入C57BL/6J小鼠受精卵雄原核。通过PCR,real-time RT PCR和反转录cDNA测序比对等手段鉴定c-Ha-ras基因的插入和表达,并结合病理切片分析自发肿瘤的发生。结果:人类原癌基因c-Ha-ras在原核注射后的基因整合率达到1.6%,共得到人类c-Ha-ras基因的插入的首建鼠6只,其中3只得以成活,并且人类c-Ha-ras基因能够稳定遗传,建成C57-ras转基因小鼠系;C57-ras转基因小鼠反转录cDNA测序比对与人源c-Ha-ras一致;3个转基因小鼠系c-Ha-ras基因的表达分别是野生型小鼠的70.53、59.07和99.68倍;病理切片分析,6只首建鼠中3只有自发肿瘤发生。结论:本研究成功建立了C57/B6J背景的人类c-Ha-ras转基因小鼠模型。该C57-ras转基因小鼠的制作和用途已申请专利(CN101532018A),这是我国首个以临床前药物致癌性实验为目的的c-Ha-ras转基因小鼠,也是在我国建立符合ICH规范的、拥有自主知识产权的临床前药物安全性致癌评价替代方法体系的基础。

转基因牛肉食用安全性的初步评价

目的通过90 d喂养试验初步评价转人α-乳清白蛋白基因牛肉的食用安全性。方法将普通牛肉和转基因牛肉分别制成牛肉粉,按照5%的比例掺入基础饲料并调整配方使之与啮齿类实验动物纯化饲料AIN93G相一致。将Wistar大鼠按体质量随机分为3组,分别以转基因牛肉饲料、普通牛肉饲料和基础饲料AIN93G喂养90 d。每日观察动物体征,每周记录动物体质量和进食量,试验结束时对动物进行尿液检查、血液细胞学和血液生化学分析,对重要脏器称重并进行组织病理学检查。结果进食含有转基因牛肉的饲料对大鼠体质量、进食量、尿液、血液细胞学和血液生化学、脏器重量及组织病理学均未产生明显改变,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论大鼠的90 d喂养试验结果提示转基因牛肉的食用安全性与普通牛肉无差别。

短发夹RNA对人骨髓间充质干细胞生长增殖的影响

目的：观察靶向人端粒酶逆转录酶（hTERT）的短发夹RNA（shRNA）对人骨髓间充质干细胞（hMSCs）生长增殖的影响，探讨靶向hTERT的RNA干扰技术临床应用的安全性。方法：根据RNA干扰原理，利用构建的表达shRNA的靶向hTERT mRNA的真核表达质粒（shRNAl），非特异性的shRNA真核表达质粒（shRNA2），转染试剂（德国metafectene）和正常培养液处理细胞。24h后在共聚焦显微镜下检测荧光表达情况；24h、48h、72h用MTT法检测细胞增殖活性；48h后进行HE染色、RT—PCR及端粒酶活性检测。结果：①共聚焦显微镜下见shRNA1及shRNA2组有大量的细胞表达荧光。②相应时间点各组细胞生长增殖无明显差异（P〉0．05）；HE染色发现，同等培养条件下。各组细胞生长密度及形态无明显变化。③RT—PCR显示各组细胞均无hTERT mRNA的表达；端粒酶活性为阴性。结论：靶向hTERT mRNA的shRNA对正常hMSCs的生长增殖无明显影响，该方法对不表达hTERT的正常体细胞可能是安全的。

我国人类精子库安全体系建设的思考

人类精子库的安全体系直接关联精子库的运行正常性和授精项目的生殖安全性,与子代的生殖健康和优生优育息息相关。我国人类精子库已正式运行20余年,不可避免地暴露出一些安全问题或风险,须予以重视和防范。本文阐述了我国人类精子库运行涉及管理安全、生殖安全和遗传安全等方面可能存在的安全问题或风险,并就人类精子库安全体系建设的可能方向提出见解,包括加强职能部门及医疗机构对人类精子库的支持及监管力度,加快建设人类精子库质量管理体系,促进人类精子库国内外学术交流,推动信息化、人工智能及基因测序等新技术在人类精子库的应用等。重视人类精子库安全体系的建设,防患于未然,对实施高质量的男性生育力保存,保障辅助生殖项目的生殖安全和生殖健康,具有积极现实意义和深远社会影响。

麻疹病毒长-47纯化株(2BS细胞)毒种库的建立

目的建立以人胚肺二倍体细胞（2BS）为基质的麻疹病毒长-47纯化株毒种库。方法将麻疹病毒长-47纯化株毒种（CEC）主代主种子批适应于2BS细胞,传至第4代和第8代,分别作为主种子批及工作种子批,对毒种进行鉴别试验、无菌试验、支原体检查、外源因子检查和病毒滴度检测,并对主种子批毒种进行猴体神经毒力试验和猴体免疫原性检测。将毒种连续传代,观察各代次病毒的收获时间,并测定病毒滴度,分析毒种的传代稳定性;将主种子批和工作种子批分别置于-20和-70℃保存,不同时间取样,检测病毒滴度,分析毒种保存温度稳定性;选取4个代次毒种（D4、D8、D15、D19）提取病毒核酸,扩增H基因序列,分析H基因在传代过程中的遗传稳定性。结果主种子批和工作种子批毒种鉴别试验、无菌试验、支原体及外源因子检查均符合《中国药典》三部（2010版）要求,病毒滴度分别为5.88和6.00 log CCID50/ml,主种子批毒种具有良好的安全性及免疫原性。麻疹病毒长-47纯化株毒种适应于2BS细胞后,收获病毒时间一般在6-7 d,病毒滴度稳定在5.5-6.5 log CCID50/ml之间。主种子批和工作种子批病毒于-20和-70℃保存10个月,病毒滴度无明显变化。D4-D19代病毒无核苷酸发生改变,与麻疹病毒Chang-47（Gen Bank登录号：EF033071）比对结果显示,D4-D19代病毒核苷酸序列21 nt由G→C,属于同义突变,同源性达99.9%。结论建立了麻疹病毒长-47纯化株（2BS）毒种库,并按照《中国药典》三部（2010版）要求进行了全面检定,为制备以人胚肺二倍体细胞为基质的麻疹减毒活疫苗奠定了基础。