Research progress and prospects of nucleic acid isothermal amplification technology

Nucleic acid(DNA and RNA)detection and quantification methods play vital roles in molecular biology.With the development of molecular biology,isothermal amplification of DNA/RNA,as a new molecular biology technology,can be amplified under isothermal condition,it has the advantages of high sensitivity,high specificity,and high efficiency,and has been applied in various fields of biotechnology,including disease diagnosis,pathogen detection,food hygiene and safety detection and so on.This paper introduces the progress of isothermal amplification technology,including rolling circle amplification(RCA),nucleic acid sequence-dependent amplification(NASBA),strand displacement amplification(SDA),loop-mediated isothermal amplification(LAMP),helicase-dependent amplification(HDA),recombinase polymerase amplification(RPA),cross-priming amplification(CPA),and its principle,advantages and disadvantages,and application development are briefly summarized.

跨越式滚环扩增(SRCA)结合金纳米粒子可视化检测食品中的沙门氏菌

沙门氏菌是引起全球人类腹泻病的主要病因,严重危害人畜健康。传统检测方法耗时长,步骤繁琐,因此开展快速简便灵敏的可视化检测方法,具有重要意义。本文设计能与靶序列结合的探针,将其与金纳米粒子(AuNPs)结合。经跨越式滚环等温扩增技术(SRCA)扩增的靶序列,高温变性后成为单链,其与金纳米粒子上的探针结合后,释放出金纳米粒子,在MgSO_(4)的作用下,聚集呈现肉眼可见的蓝色,判定为阳性,阴性为紫色。依此,建立一种简便、快捷、灵敏的可视化检测方法。结果表明:该方法特异性良好,能够区分8株沙门氏菌阳性与8株非沙门氏菌阴性。可视化检测的灵敏度为5.5×10^(0)CFU/mL。将牛奶样品人工污染沙门氏菌,检出限为3.7×10^(0)CFU/mL。在50份实际样品检测中,与GB 4789.4-2016方法进行比较,该方法敏感性为100.00%,特异性为97.87%,符合率达到98.00%。本文建立的SRCA-AuNPs可视化检测方法,具有较高的应用价值,结果肉眼可见,适合于现场可视化检测和基层单位使用。

PMA⁃SRCA可视化检测海产品中的活副溶血性弧菌

为可视化检测海产品中的活副溶血性弧菌,该研究将叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)染料与跨越式滚环等温扩增(saltatory rolling circle amplification,SRCA)技术相结合,以toxR为靶基因,设计并筛选引物,成功建立可视化PMA⁃SRCA检测方法,并评估所建立的方法。研究表明,12株副溶血性弧菌样品呈现阳性,29株非副溶血性弧菌样品呈现阴性,表明该方法特异性良好。该方法灵敏度为3.2×100 CFU/mL,高于可视化PMA⁃环介导等温扩增(3.2×101 CFU/mL)和可视化PMA⁃聚合酶链式反应(3.2×102 CFU/mL)的灵敏度。对76份市售海鲜样品进行检测,该方法的敏感性为100.00%,特异性为92.00%,符合率为97.37%。综上所述,可视化PMA⁃SRCA检测方法可检测活的副溶血性弧菌,具有良好的特异性、较优异的灵敏度。

实时荧光跨越式滚环等温扩增技术检测蜂蜜掺伪大米糖浆

将跨越式滚环等温扩增技术(SRCA)与荧光技术相结合,建立一种实时荧光SRCA技术检测蜂蜜掺伪大米糖浆的方法。对DNA提取方案进行评估,以大米的特异性基因(PDL、SPS、rbcL、GOS9)为靶序列设计引物,筛选适宜的引物,优化扩增反应条件结合荧光技术建立检测蜂蜜掺伪大米糖浆的方法,并对该方法进行评价。结果表明,建立的实时荧光SRCA方法检测大米DNA的灵敏度为8.45×10~1fg/μL,经特异性评价证实其特异性良好,在人工模拟掺伪检测中建立掺伪比例的对数与Ct值的线性关系,线性方程为y=6.618x+7.651(R~2=0.993),可准确检出蜂蜜中低至1%的大米糖浆成分。该方法灵敏度高,检出限低,能够快速、准确检测蜂蜜掺伪大米糖浆,为蜂蜜掺伪的快速检测提供了新思路。

跨越式滚环等温扩增试剂盒检测沙门氏菌的研究

沙门氏菌可引起食源性疾病,严重危害食品安全和人类健康。因此,开发新的检测方法尤为重要。本研究基于自主研发的新型核酸扩增方法--跨越式滚环等温扩增,研制了检测沙门氏菌的试剂盒,并对该试剂盒相关性能进行评估。结果显示,试剂盒检测沙门氏菌的特异性良好,灵敏度为4.1×10^(1)CFU·mL^(-1),有效期可达90 d,表明该试剂盒可靠、灵敏、稳定,可满足食品中沙门氏菌快速检测的需求。

重症肌无力患者血浆染色体外环状DNA的分子特征

目的对重症肌无力(myasthenia gravis,MG)患者血浆染色体外环状DNA(extrachromosomal circular DNA,eccDNA)进行全长测序,分析eccDNA的分子特征及潜在功能,初步探索eccDNA在MG发病过程中的作用机制。方法收集2例MG患者及2例性别、年龄与之匹配的健康人血浆样本,基于滚环扩增和纳米孔测序全新技术平台,对血浆eccDNA进行全长测序,分析比较MG患者与健康人血浆eccDNA的长度分布、染色体来源、基因组元件分布及eccDNA相关差异基因功能富集情况。结果在MG患者和健康对照者中,长度为250~500 bp的eccDNA均分布最多,且MG患者在150~300 bp之间eccDNA呈现另一分布高峰,对照组则在此区间的eccDNA丰度极低。健康对照组eccDNA在1号染色体上分布最多,而MG患者组eccDNA在2号染色体上分布最多;MG患者eccDNA来源基因组元件在内含子、远端基因间区占比均高于健康对照者,而外显子区占比均低于健康对照者。相较于健康对照组,MG患者组eccDNA差异基因富集的通路多与氯离子通道活性、氯离子跨膜转运、钙离子结合及细胞信号传导有关。结论MG患者与健康人血浆eccDNA的分子特征(大小分布、染色体来源、基因组元件分布、eccDNA基因功能富集)存在差异,提示eccDNA可能通过基因表达调控、细胞信号传导、神经突触发育及免疫功能调节等潜在功能影响MG的发生发展,eccDNA可能成为MG早期诊断和疗效监测的新型生物标志物。

可视化跨越式滚环等温扩增技术检测食品中沙门氏菌

建立一种新型的核酸体外等温扩增方法--可视化跨越式滚环等温扩增技术(SRCA)检测沙门氏菌。根据沙门氏菌stn基因序列设计引物,进行特异性验证。测定该技术的灵敏度以及人工污染鸡肉样品的检出限。通过检测多种实际食品样品,评价SRCA方法的敏感性、特异性和符合率。研究结果表明:所有沙门氏菌呈阳性结果,非沙门氏菌呈阴性结果,说明引物特异性良好。SRCA方法检测沙门氏菌DNA的灵敏度为5.6×10^0 fg/μL,检出限为3.8×10^1 CFU/mL;PCR方法的灵敏度为5.6×10^2 fg/μL,检出限为3.8×10^3 CFU/mL。该方法检测30个实际样品的检出率为13.33%,并与GB 4789.4-2016方法进行比较,其敏感性、特异性和符合率分别为100%,96.30%和96.67%。结论:可视化跨越式滚环等温扩增技术具有操作简便,特异性强,灵敏度高,检出限低,检测成本低,对试验设备要求低等优点,适用于基层单位对食品中沙门氏菌的快速检测。

核酸恒温扩增技术研究进展

核酸恒温扩增技术在生命科学研究及相关诸多领域已经得到了广泛应用。我们对核酸恒温扩增技术的最新进展作一简要综述,包括环介导恒温扩增、链替代扩增、依赖核酸序列的扩增、滚环扩增、切口酶核酸恒温扩增、依赖解旋酶的恒温扩增、转录依赖的扩增、杂交捕获法、转录介导的扩增等的原理、优缺点及应用。

微量病原检测技术研究进展

微量病原由于其浓度很低,达不到常规检测技术的检测灵敏度,导致不可避免的漏检。近年来,新发展起来了一些专门针对微量病原的灵敏、特异、快速的检测技术,包括PCR-ELISA、PCR-MPH、IC-PCR、IM-PCR、IMS-ELISA、IMS-PCR、HC-PCR-MPH、HC-realtimePCR、RCA、LAMP等均可不同程度的解决以上问题。

三向连接构造组合引物介导的滚环扩增技术检测肠道病毒71型方法的建立

目的建立三向连接构造(3WJ)组合引物介导的滚环扩增(PG-RCA)技术检测肠道病毒71型(EV71)的方法,并验证其检测效果。方法根据EV71的VP1基因保守区设计引物模板、引物以及环状探针前体,确立反应体系及反应条件,实时荧光PCR仪监测扩增结果。采用已建立的3WJ组合PG-RCA技术检测16例手足口病患儿咽拭子标本(EV71阳性12例、柯萨奇病毒A阳性2例、柯萨奇病毒B阳性2例)。结果已建立的3WJ组合PG-RCA技术能检测到amol级的EV71 RNA,说明方法建立成功。EV71阳性标本扩增曲线荧光强度均超过阈值;柯萨奇病毒A、B阳性标本扩增曲线荧光强度均低于阈值。结论成功建立3WJ组合PG-RCA技术检测EV71的方法,检测效果好。

跨越式滚环等温扩增技术结合CRISPR/Cas12a定量检测海产品中的副溶血性弧菌

将CRISPR/Cas12a系统与跨越式滚环等温扩增技术(saltatory rolling circle amplification,SRCA)相结合,建立一种快速、灵敏定量检测海产品中副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)的方法(SRCA-Cas12a)。通过SRCA扩增靶标DNA,CRISPR/Cas12a系统识别靶标DNA并裂解单链报告探针,从而建立SRCA-Cas12a检测方法。分析该方法的特异性与灵敏度,并进行加标回收实验和实际样品检测。结果显示该方法可区分副溶血性弧菌和其他食源性致病菌,特异性良好。在最优检测体系下,建立了副溶血性弧菌菌液浓度的对数与荧光信号强度的线性关系,线性方程为y=1.8472x+2.4738(R^(2)=0.9866),检出限为3.6 CFU/mL(R_(SN)=3)。在人工污染样品中副溶血性弧菌的加标回收率为95.5%~104.4%。在实际样品检测中,该方法的敏感性为100.0%、特异性为95.2%、符合率为97.2%。本研究所建立的SRCA-Cas12a方法具有特异性好、检测限低的优点,为副溶血性弧菌的快速定量检测提供了一种新策略。

可视化跨越式滚环扩增技术检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌

建立一种新型的单核细胞增生李斯特氏菌检测方法,即通过可视化跨越式滚环等温扩增(saltatory rolling circle amplification,SRCA)技术检测单核细胞增生李斯特氏菌。根据单核细胞增生李斯特氏菌hlyA基因序列设计引物,进行特异性验证,对灵敏度和人工污染样品的检出限进行测定。通过检测70种实际食品样品对SRCA方法的敏感性、特异性和符合率进行评价。结果表明:所有单核细胞增生李斯特氏菌呈阳性结果,非单核细胞增生李斯特氏菌呈阴性结果,说明该方法特异性良好。SRCA方法的灵敏度为8.9×10^(0)fg/μL,是传统聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法的1000倍,检出限为2.8×10^(0)CFU/g,是传统PCR方法的1/1000。在实际样品的检测中,SRCA方法与GB 4789.30—2016《食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌》方法进行比较,其敏感性、特异性和符合率分别为100%、97.01%和97.14%。可视化SRCA技术具有操作简便、设备简单、特异性强、灵敏度高、检出限低、检测成本低等优点,适合在基层单位和中小型食品企业中推广应用。

食品中沙门氏菌FTA膜结合跨越式滚环等温扩增检测方法的建立

为实现食品中沙门氏菌的简便和快速现场检测,本研究采用FTA膜(Flinders technology associates,FTA)结合跨越式滚环等温扩增(Saltatory rolling circle amplification,SRCA)方法(FTA-SRCA)建立一种新型的沙门氏菌检测方法。利用FTA膜快速提取模板DNA,根据沙门氏菌的inv A基因设计及筛选引物,建立FTA-SRCA反应体系。扩增反应在能够实现集约化检测的凹孔板中进行,反应结束后添加荧光染料观察结果。确定了该方法的特异性、灵敏度和人工污染样品的检出限,并对60个实际样品进行检测,评估其敏感性、特异性和符合率。结果表明:检测的17株沙门氏菌均为阳性结果,29株非沙门氏菌均为阴性结果,特异性良好。FTA-SRCA方法的灵敏度为6.81×100 CFU/m L,比PCR方法高100倍,比SRCA方法高10倍。对于人工污染的牛奶样品检测,FTA-SRCA方法的检出限为3.22×100CFU/m L,比PCR方法低1000倍,比SRCA方法低10倍。检测实际样品的敏感性、特异性和符合率分别为100.00%,94.64%,95.00%。本研究建立的FTA-SRCA方法具有操作简便快速、成本低廉、特异性强、灵敏度高、检出限低等优点,可用于食品中沙门氏菌的大批量集约化快速现场检测。

可视化-跨越式滚环等温扩增技术检测鼠肉掺假

目的建立可视化-跨越式滚环等温扩增技术检测肉制品中鼠肉掺假的分析方法。方法选取鼠的线粒体cytb基因为靶基因,设计并筛选出一对引物,选择9个不同物种的新鲜肌肉组织样本为研究对象,验证跨越式滚环等温扩增技术(saltatory rolling circle isothermal amplification, SRCA)方法的特异性;测定该技术的灵敏度以及人工污染样品中鼠肉成分的检出限,验证SRCA方法的准确性。结果 SRCA荧光可视化法检测鼠肉DNA的灵敏度为7.3×100fg/μL,与传统PCR方法相比,SRCA荧光可视化法的灵敏度提高了1000倍。在人工添加鼠肉的模拟掺假样品中, SRCA方法可检测到含量为0.01%的鼠肉。结论 SRCA技术可以灵敏、快速、准确地检测出肉制品中的鼠肉掺假成分,适用于基层单位对肉制品掺假的快速检测。

可视化跨越式滚环等温扩增技术在猪肉掺假检测中的应用

目的:建立了一种跨越式等温扩增技术(SRCA)结合荧光染料SYBR Green I检测肉制品中猪肉掺假的方法。方法:根据NCBI中猪的线粒体序列,通过DNAMAN等软件设计SRCA的特异性引物,分别采用普通SRCA和荧光可视化SRCA的方法建立肉制品中猪肉成分的检测方法,对9个不同物种的新鲜肌肉组织样本进行实验从而验证SRCA方法的特异性,并对66份未标识猪肉成分商业肉制品进行猪肉成分的检测。结果:SRCA荧光可视法检测猪肉DNA的灵敏度为6.5 fg/μL,与传统PCR方法相比,SRCA荧光可视法的灵敏度提高了1000倍。在人工添加猪肉的混合样品中,SRCA方法检测猪肉含量为0.01%(w/w)。与NY/T 3309-2018行业标准相比,SRCA方法检测肉制品中猪肉的敏感性、特异性和符合率分别为100%、96.66%、98.48%。结论:SRCA是一种检测肉制品中猪肉掺假的灵敏、直观的方法,具有很大的应用潜力。

烟草突变体库的创建策略及其应用

烟草(Nicotiana tabacum)是重要的经济作物及研究植物生命活动的模式植物。目前烟草突变体已广泛应用于烟草功能基因组研究及遗传育种,大规模高效烟草突变体库的创建将进一步推动烟草功能基因组研究,加快新品种的培育。综述了化学诱变、电离辐射和插入标签法在烟草突变体库创建中的应用;此外,针对烟草基因组的特点,结合近年来一些植物功能基因组研究的新技术、新方法,提出了烟草突变体库创建的新策略,即基于Gateway技术的烟草全基因组过量表达策略和基于RMHR技术的烟草EST-RNA干涉策略,并就如何应用这些突变体库进行烟草功能基因组研究进行了探讨。

PMA-RF-SRCA检测乳中单增李斯特氏菌活菌

本研究建立了一种叠氮溴化丙锭(PMA)与实时荧光跨越式滚环等温扩增(RF-SRCA)相结合的方法,可以高效灵敏检测乳中活的单增李斯特氏菌。以hlyA基因为靶点,设计并筛选出特异性引物,通过对PMA的工作浓度、暗孵育时间和光反应时间进行优化,确定了最佳的处理条件。此外,对该方法的特异性、灵敏度及检出限进行了分析。结果表明,该方法引物特异性良好,6株单增李斯特氏菌结果均为阳性,12株非单增李斯特氏菌结果均为阴性;当PMA工作浓度为30μmol/L、暗孵育10 min、光反应15 min时,所建立的方法灵敏度为3.9 CFU/mL,人工污染乳制品的检出限为1.56×10 CFU/mL。综上所述,本研究所建立的PMA-RF-SRCA方法特异性强,灵敏度高,为检测食品中活的单增李斯特氏菌提供了新的思路。

实时荧光跨越式滚环等温扩增结合PMA检测虾产品中的活副溶血性弧菌

目的:为快速检测虾产品中的活副溶血性弧菌,建立一种实时荧光跨越式滚环等温扩增(real-time fluorescent saltatory rolling circle amplification,RF-SRCA)与叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)染料相结合的检测方法。方法:依据副溶血性弧菌的特异性基因toxR设计并筛选引物,对PMA-RF-SRCA检测方法进行特异性、灵敏度及检出限分析,并与PMA-实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)方法进行对比。对76份样品进行检测,以GB 4789.7—2013方法为标准,对PMA-RF-SRCA方法的相对敏感性、相对特异性、相对符合率进行计算,以对本方法的实用性进行评估。结果:此方法的引物特异性良好,12株副溶血性弧菌结果均呈阳性,18株非副溶血性弧菌结果均呈阴性;PMA-RF-SRCA法灵敏度为3.2×10^(0) CFU/mL,检出限为2.08×10^(1) CFU/g,此方法的灵敏度是PMA-real-time PCR的100倍。经过实际样品检测,PMA-RF-SRCA方法的敏感性、特异性、符合率分别为100.00%、96.00%和98.68%。结论:PMA-RF-SRCA方法特异性强、灵敏度高,可用于虾产品中的活副溶血性弧菌的检测与筛查。

基于链置换反应的DNA等温扩增技术应用进展

DNA等温扩增是在恒定温度下用非热变性的方法解开DNA双链的一种扩增技术。链置换反应指某些具有链置换活性的DNA聚合酶在延伸新链的同时将下游旧链剥离,它已被用于多种体外等温扩增技术,包括链置换扩增、滚环扩增、多重置换扩增、环介导的等温扩增等。其主要应用于DNA测序、全基因组扩增、基因芯片、微生物病原体检测等领域。

实时荧光跨越式滚环等温扩增技术检测食品中的志贺氏菌

该研究建立一种实时荧光跨越式滚环等温扩增(real-time fluorescence saltatory rolling circle amplification,RFSRCA)技术快速检测志贺氏菌(Shigella)。该方法以志贺氏菌的ipaH基因设计引物,使用32株不同菌株对RF-SRCA方法的特异性进行分析,根据实时荧光曲线法对RF-SRCA方法的灵敏度和检出限进行判定,并使用该方法对60份食品样品进行检测。结果表明:13株志贺氏菌菌株呈阳性结果,19株非志贺氏菌菌株呈阴性结果,说明该方法特异性良好;RF-SRCA的灵敏度为5.97×10^(0)fg/μL,比普通SRCA方法高10倍;其在人工污染牛奶样品中的检出限为8.6×10^(0)CFU/mL,比普通SRCA方法检出限低10倍;60份食品样品中阳性样品数为2份,其检出率与SRCA方法一致,为3.33%。综上,RF-SRCA方法在检测志贺氏菌方面操作简单,特异性强,灵敏度高,能够实现快速检测。