Duplex PCR Detection of Pseudomonas savastanoi pv.phaseolicola and Curtobacterium flaccumfaciens pv,flaccumfaciens in Soybean

The paper aimed to establish a duplex PCR method for simultaneous detection of Pseudomonas savastanoi pv. Phaseolicola （Psp） and Curtobaeterium /accumfadens pv. Flaccumfaciens （Cff）. Based on the argK gene of Psp in GenBank, the primers PSPF1/PSPR2 were designed. The duplex PCR assay was dereloped using the combined primers PSPF1/PSPR2 and CflF1/CffR2, which were specific primers for Cff. The reaction conditions were optimized and specificity md sensitivity of the duplex PCR were tested. The expected DNA fragment was specifically amplified from the genomic DNA of Psp and Cff. Specificity was conirmed in the artificially inoculated soybean samples imparted. Thus, the duplex PCR developed in this study could be used for the simultaneous detection of Psp md Cff from imported soybean.

进口大豆中菜豆晕疫病菌巢式PCR检测方法的建立

为实现对进口大豆样品中菜豆晕疫病菌的快速检测,本研究根据菜豆晕疫病菌的argK特异性序列设计引物52B/8F和24B/24F,建立了巢式PCR检测方法,并进行特异性和灵敏度验证。试验结果表明,利用此检测方法对多种参试菌株进行检测时,只有菜豆晕疫病菌呈阳性反应,而其他病菌不产生扩增反应;巢式PCR检测方法对菜豆晕疫病菌基因组DNA和菌悬液检测时,其灵敏度分别达到0.916×10-4ng/μL和2.4×103CFU/m L,比常规PCR灵敏度高1 000倍。在对100份进口大豆样品检测时,3份样品扩增到了特异性条带,测序分析结果证明3份大豆样品中携带的病菌确实为菜豆晕疫病菌。本研究所建立的巢式PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高、检测时间短并且检测准确率高等特点,可用于口岸菜豆晕疫病菌的检测。

双重PCR法同步检测菜豆晕疫病菌和萎蔫病菌

为建立同步检测菜豆晕疫病菌和细菌性萎蔫病菌的双重PCR方法,根据Gen Bank上公布的菜豆晕疫病菌arg K基因特异性序列设计1对特异性引物PSPF1/PSPR2,将设计的引物与已发表的检测菜豆细菌性萎蔫病菌特异性引物Cff F1/CffR2结合,经过条件优化,建立了双重PCR反应体系,并进行特异性和灵敏度验证。结果显示,采用双重PCR体系,能从菜豆晕疫病菌和细菌性萎蔫病菌基因组DNA以及人工模拟带菌大豆种子样品中扩增到特异性条带,表明本研究所建立的双重PCR检测方法能同时检测出菜豆晕疫病菌和细菌性萎蔫病菌,可用于口岸进口大豆中2种检疫性细菌的检测。

上海地区大豆细菌性“叶斑病”病原研究

从上海地区的大豆叶斑病病株和病种上分离出20个细菌菌株,经菌体形态、培养性状、生理生化、致病性、Biolog和脂肪酸测定,并与12个国际标准菌株比较,在国内首次明确了大豆"叶斑病"是由大豆细菌性疫病菌Pseudomonas savastanoi pv.Glycinea(萨氏假单胞菌大豆致病变种)引起。种子可带菌和传病,10份自然病种的平均种子带菌率在7.6%,传病率在0.48%。

菜豆晕疫病菌环介导等温核酸扩增检测方法的建立

为了建立菜豆晕疫病菌的环介导等温扩增方法,本试验利用菜豆晕疫病菌arg K特异性序列设计环介导等温核酸扩增(LAMP)引物,进行反应条件和反应体系的优化,并进行特异性和灵敏度验证。特异性检测结果显示,5株菜豆晕疫病菌的LAMP产物呈阳性结果,而参试的其他病原菌不产生扩增反应。LAMP检测基因组DNA和菌悬液时,其灵敏度分别达到0.632×10-4ng/μl和7.3×102CFU/ml,该方法比常规PCR灵敏度高100倍。表明本研究所建立的LAMP检测方法简便、快速、准确、灵敏,可有效应用于口岸菜豆晕疫病菌的检测。

微滴式数字PCR技术在菜豆晕疫病菌检测中的应用

为了建立菜豆晕疫病菌(Pseudomonas savastanoi pv.phaseolicola)微滴式数字PCR(ddPCR)检测方法,实现菜豆晕疫病菌的高效率、高精度的检疫鉴定和疫情监控,以菜豆晕疫病菌为研究对象,以位点特异性重组酶作为靶标基因,SSRP_F、SSRP_R、SSRP_P为特异性引物与探针,建立菜豆晕疫病菌ddPCR反应体系,结果表明,菜豆晕疫病菌的ddPCR检测体系的绝对定量检测低限为0.6 copies/μL,ddPCR的检测灵敏度比常规PCR高2个数量级。同时研究了种子携带菜豆晕疫病菌是否具有活性,提高了疫情检出率。

基于锁式探针技术的菜豆晕疫病菌检测技术研究

根据菜豆晕疫病菌的一段特异促旋酶亚组B（gyr B）基因序列,设计锁式探针和扩增引物,优化体系反应条件,建立了基于锁式探针菜豆晕疫病菌滚环扩增特异性检测体系。试验结果表明该检测体系能够从供试菌株中特异性检测出菜豆晕疫病菌。该体系检测DNA的阈值为600 fg/μL,与传统PCR相当;检测菌悬液检测阈值1.3×10~3 cfu/m L,比传统PCR高10倍,在模拟样品检测中也显示了更适合于样品的检测。

大豆携带菜豆晕疫病菌PCR检测技术研究

晕疫病是豆科作物上重要的检疫性细菌病害。本研究在传统PCR检测技术的基础上,分析了细菌洗涤液、洗涤时间以及洗涤液容量对一粒带菌大豆检出率的影响,以及有效检出不同带菌率大豆的最佳检测时间。结果表明,洗涤液种类、洗涤时间以及洗涤液容量对检测结果影响不大,但对不同带菌率大豆洗涤时间的长短直接影响病菌的检出率,实验表明振荡洗涤时间8 h,可检测到的大豆种子最低带菌率为0.0625%。本研究所建立的检测方法简便易行,可有效应用于口岸检测进口大豆中的菜豆晕疫病菌。

日本菜豆种子中菜豆晕疫病菌的检疫鉴定

利用MT选择性培养基从来自日本的菜豆种子样品上分离到1株细菌分离物(编号1160),对该分离物进行培养性状观察、特异引物PCR检测、多位点序列分析、烟草过敏性反应和致病性测试。结果表明:该分离物菌落在MT上呈白色、略扁平、无水解圈,经菜豆晕疫病菌(Pseudomonas savastanoi pv. phaseolicola,Psp)特异引物PHA19/PHA95及P5.1/P3.1扩增,获到437 bp及500 bp目的条带,并与Psp菌株LMG2245及GenBank中Psp(基因登录号:AB237164、CP000058)的序列相似性均为100%。选择gap1、gltA、gyrB、rpoD 4个看家基因进行多位点序列分析(MLSA),系统发育树显示分离物1160与Psp菌株LMG2245、1448A聚在同一分支。该分离物人工接种菜豆叶片能引起典型的黄色晕疫病害症状,接种菜豆荚果引起水渍及褐变病害症状;接种烟草叶片可产生过敏性反应。根据上述试验结果,将分离物1160鉴定为菜豆晕疫病菌。这也是全国首次从进境商品中截获菜豆晕疫病菌。