限制性外切酶Ⅰ(EXO1)的合成、克隆与表达

【目的】核酸外切酶I(Exonuclease 1,EXO1)是一种多功能的3’→5’外切酶,主要应用于清除DNA或RNA双链分子中存在的单链。目前商品化的EXO1都是在大肠杆菌中诱导表达,表达量不高,且后续纯化步骤复杂。人工合成核酸外切酶I sbcB基因,并在大肠杆菌中高效表达及纯化。【方法】采用重叠PCR合成sbcB基因,通过酶切将其克隆至表达载体pET-30a上并转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,并对表达条件进行优化,获得限制性外切酶Ⅰ(EXO1)的大量表达。亲和层析纯化重组蛋白后对酶的活性进行研究。【结果】亲和纯化后获得大量表达蛋白EXO1,大小与预测的54.5 KD相符;以S1核酸外切酶为对照进行的功能验证证实:sbcB基因表达产物EXO1能够消化单链,但不会消化双链,纯化的EXO1具有很好的酶活性。【结论】依据本文方案制备的限制性外切酶Ⅰ(EXO1)产量高、纯度高,适用于实验室测序前PCR产物的处理。