小麦籽粒胚乳基因sbe2b cDNA的克隆与原核表达条件的优化

本研究采用RT-PCR技术克隆了小麦胚乳基因sbe2b全长cDNA序列。序列分析表明,该序列与已报道的sbe2bcDNA序列(登录号:AY740401)同源性为98%。同时构建了原核生物表达载体pET28(a+)-sbe2b,对不同的IPTG诱导浓度和诱导时间等条件的优化结果表明,37℃8h能诱导sbe2b融合蛋白的最大量表达,在0.5mmol/LIPTG浓度下可以成功表达出sbe2b蛋白。为进一步体外研究sbe2b的物理化学性质及催化机理奠定基础。

小麦籽粒胚乳中淀粉分支酶基因的RNAi表达载体的构建及表达

构建sbe2b的RNAi表达载体,并对其转化烟草,检测其对直链淀粉合成的影响。利用网络数据库http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/,确定小麦胚乳淀粉分支酶sbe2b的部分基因序列作为RNAi的目标序列,通过RT-PCR方法从小麦籽粒胚乳中成功克隆出了小麦胚乳中淀粉分支酶sbe2b基因的部分序列(300 bp)(GenBank No.AY740401),以植物表达载体PZP35S为基础,构建了由组成型启动子35S调控的sbe2b基因的RNAi植物表达载体。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测其在转基因烟草中的相对表达量,并测定转基因植株中直链淀粉的含量和支链淀粉含量的变化。结果表明:经qRT-PCR证实sbe2b基因的表达量较对照下降,而且支链淀粉含量变化显著,直链淀粉较对照有上升但变化没有达到显著水平。

大麦转玉米淀粉分支酶基因的初步研究

以5个大麦品种的由成熟胚再生体系产生的胚性愈伤组织为受体材料,以构建好的Bar基因为选择基因的玉米淀粉分支酶基因表达载体为目的基因,用基因枪法对其进行了转化.在转化的大麦中,5个不同基因型品种的抗性愈伤获得率为10.32 %～17.13 %,将抗性愈伤组织转移到分化培养基中进行分化,绿苗分化率为0 %～14.29 %,移栽到小花盆中的再生植株有28株.其中87-3175有11株,87-0053有9株,97-4010有3株,97-6004未分化出苗,208813-509有5株;移栽成活的87-3175有4株,87-0053有5株,208813-509有3株.对10株再生植株进行了PCR检测,其中有7株扩增出0.5kb的Bar基因特异条带,2株扩增出2.4 kb的sbe2b基因特异条带,3株扩增出2.5 kb的sbe1基因特异条带.对PCR扩增的条带回收测序,测序结果与各自的基因序列相符合,说明外源基因已经整合到大麦基因组中.