小麦籽粒胚乳基因sbe2b cDNA的克隆与原核表达条件的优化

本研究采用RT-PCR技术克隆了小麦胚乳基因sbe2b全长cDNA序列。序列分析表明,该序列与已报道的sbe2bcDNA序列(登录号:AY740401)同源性为98%。同时构建了原核生物表达载体pET28(a+)-sbe2b,对不同的IPTG诱导浓度和诱导时间等条件的优化结果表明,37℃8h能诱导sbe2b融合蛋白的最大量表达,在0.5mmol/LIPTG浓度下可以成功表达出sbe2b蛋白。为进一步体外研究sbe2b的物理化学性质及催化机理奠定基础。

小麦籽粒胚乳中淀粉分支酶基因的RNAi表达载体的构建及表达

构建sbe2b的RNAi表达载体,并对其转化烟草,检测其对直链淀粉合成的影响。利用网络数据库http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/,确定小麦胚乳淀粉分支酶sbe2b的部分基因序列作为RNAi的目标序列,通过RT-PCR方法从小麦籽粒胚乳中成功克隆出了小麦胚乳中淀粉分支酶sbe2b基因的部分序列(300 bp)(GenBank No.AY740401),以植物表达载体PZP35S为基础,构建了由组成型启动子35S调控的sbe2b基因的RNAi植物表达载体。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测其在转基因烟草中的相对表达量,并测定转基因植株中直链淀粉的含量和支链淀粉含量的变化。结果表明:经qRT-PCR证实sbe2b基因的表达量较对照下降,而且支链淀粉含量变化显著,直链淀粉较对照有上升但变化没有达到显著水平。