靶向人c-Cbl基因重组干扰慢病毒与过表达腺病毒载体的构建、鉴定以及病毒功效研究

目的:构建可调控c-Cbl基因表达的重组慢病毒与腺病毒并评估其功效。方法:应用基因重组技术,分别构建靶向人c-Cbl基因的干扰慢病毒和过表达腺病毒。采用定量PCR和免疫印迹法检测病毒感染后白血病细胞(HL60、THP1)c-Cbl基因表达与转录本的变化。结果:3个靶向人c-Cbl基因的重组干扰慢病毒载体经测序验证构建成功,包装的病毒滴度均大于1×10^(8)TU/ml,其中shRNA-2号慢病毒干扰效率最高,白血病细胞感染后c-Cbl基因的表达约下调95%,CBL蛋白的表达约下调60%;同时,靶向人c-Cbl基因的重组过表达腺病毒载体也经测序验证构建成功,包装的病毒滴度大于1×10^(9)TU/ml,细胞感染腺病毒后,c-Cbl基因表达可瞬时上调约10倍,CBL蛋白表达约上调1.5倍。结论:重组干扰慢病毒和过表达腺病毒均可高效感染白血病细胞,并能分别下调和上调c-Cbl基因与CBL蛋白的表达,为后续研究肿瘤细胞内c-Cbl基因功能打下前期基础。

羊传染性脓疮病毒ORF047酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

为研究羊传染性脓疮病毒(Orf virus,ORFV)ORF047编码IMV上的膜蛋白在病毒与宿主互作过程中的功能,本研究选择pBT3-N和pBT3-SET两种不同表达特性的诱饵载体,分别成功构建了pBT3-N-ORF047、pBT3-SET-ORF047和pBT3-SETORF047-183AA三个诱饵质粒,并进行自激活作用和对酵母毒性作用的检测。结果表明:用诱饵载体pBT3-N构建的诱饵质粒pBT3-N-ORF047可用于筛选羊睾丸cDNA文库,这为后续以ORF047膜蛋白和羊睾丸细胞膜文库为研究系统、筛选病毒与宿主互作蛋白的研究奠定了基础。

禽用活病毒载体疫苗的研究进展

疫苗接种是家禽疾病防控最有效的策略之一,随着分子生物学的发展,重组DNA技术被广泛用于许多新型家禽疫苗的构建和生产中。就近年来常用的火鸡疱疹病毒、鸭瘟病毒、传染性喉气管炎病毒、禽痘病毒、新城疫病毒等活病毒载体疫苗研究进展进行综述,分析其临床应用、优缺点等,为开发更加安全有效的家禽活病毒载体疫苗提供参考。

牦牛六个多能性相关转录因子OSKMNL的克隆和多顺反子慢病毒载体的构建

旨在克隆牦牛6个多能性相关转录因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog、Lin28(OSKMNL),构建多顺反子慢病毒载体FUW-teto-OSM-EGFP和FUW-teto-KNL-mCherry。本研究以1头3~5月龄健康雌性牦牛胎儿的生殖嵴组织为研究材料,利用RT-PCR技术克隆牦牛6个多能性相关转录因子OSKMNL的完整编码区序列,并对其进行生物信息学分析;应用无缝克隆技术构建慢病毒载体FUW-teto-OSM-EGFP和FUW-teto-KNL-mCherry;用293T细胞包装慢病毒,将包装好的慢病毒感染293T细胞和牦牛成纤维细胞,通过观察荧光表达和RT-PCR技术检测病毒感染情况(试验分为病毒感染组和空白对照组,每个组设置3个重复)。结果表明,克隆的牦牛OSKMNL基因的编码区大小分别为1 083、963、1 434、1 320、903、618 bp;序列分析发现牦牛OSKMNL氨基酸序列与黄牛的同源性在99%以上,其中Sox2、Klf4、c-Myc与黄牛的同源性为100%;进化树结果显示牦牛与黄牛、瘤牛、水牛的亲缘关系最近,与小鼠的亲缘关系最远;蛋白结构预测发现牦牛的6个转录因子OSKMNL都具有该基因家族相应蛋白功能的结构,比如POU结构域、HOX结构域、HMG结构域、Znf-C2H2结构域、HLH结构域、CSP结构域等;构建了慢病毒载体FUW-teto-OSM-EGFP和FUW-teto-KNL-mCherry;慢病毒感染293T细胞发现试验组表达红色和绿色荧光;慢病毒感染牦牛成纤维细胞发现试验组表达红色和绿色荧光,RT-PCR结果显示预期大小的条带。本研究成功克隆了牦牛的6个多能性相关转录因子OSKMNL;构建了分别携带牦牛3个转录因子的慢病毒载体FUW-teto-OSM-EGFP和FUW-teto-KNL-mCherry;包装的慢病毒能感染牦牛成纤维细胞。有利于推动多能性相关转录因子OSKMNL在牦牛干细胞中的应用,也为后续研究牦牛iPSC做准备。

禽腺病毒载体疫苗研究进展

禽腺病毒(FAdV)是危害家禽养殖业的重要病原之一,具有高致病性和传染性。近年来,随着基因工程技术的发展,已研发出许多新型疫苗,其中病毒载体疫苗因具有用量少、成本低等独特的优势以及广阔的应用前景,成为当今与未来疫苗研发的重要方向。腺病毒具有结构简单、宿主范围广泛、外源基因容载量大、易进行遗传操作、易转染等特点而被广泛用作疫苗载体。其中FAdV基因组比哺乳动物腺病毒大10 kb左右,且具有更大的外源DNA容载量,因此对FAdV载体的深入研究将对禽类疫病预防起到重要作用。本文综述了FAdV的病原特点以及国内外FAdV载体研究现状,以期为进一步研发FAdV载体疫苗提供理论基础。

核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白6重组腺病毒过表达载体的构建与鉴定

目的构建及鉴定携带小鼠核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白6(NLRP6)基因(NM_133946.2)的过表达重组腺病毒载体。方法合成小鼠NLRP6基因的编码序列,经酶切后插入腺病毒载体(GL2003),转化大肠杆菌感受态细胞DH-5α进行培养,挑取转化子,进行聚合酶链反应(PCR)鉴定后送测序进行比对。采用蛋白质印迹法(Western blot)验证重组质粒中NLRP6蛋白的表达。利用Admax包装系统获得重组腺病毒载体Ad-NLRP6,导入HEK293细胞,经扩增纯化后测定病毒滴度。结果双酶切及DNA测序证明NLRP6成功构建入表达质粒中,同时检测其携带的FLAG标签蛋白,表明NLRP6表达水平显著升高。包装并生产携带NLRP6的重组腺病毒,进一步将病毒感染HEK293细胞,Ad-NLRP6细胞表达绿色荧光蛋白提示感染成功,收集病毒,经扩增纯化后测定病毒滴度为4×10^(10)PFU/mL。结论成功构建携带小鼠NLRP6基因的过表达重组腺病毒载体,这一结果为进一步研究NLRP6分子学功能提供了有效工具。

鸭瘟病毒载体疫苗研究进展

疫苗接种是控制疫病的有效方法一,其中病毒载体疫苗以其转染效率高、外源基因表达水平高等优点成为当前疫苗的重要研究方向。鸭瘟病毒基因非常适合作为插入和表达其他病原体的外源抗原基因,并且随着CRISPR/Cas9技术、细菌人工染色体技术、同源重组技术等基因编辑技术的发展,鸭瘟病毒作为最有前途的载体被广泛应用于传染病疫苗研发。经试验验证,基于重组鸭瘟病毒载体的禽细菌病疫苗以及禽流感、鸭病毒性肝炎等多种病毒病疫苗均具有较好的免疫效果和安全性。本文综述了鸭瘟病毒作为疫苗载体的特点、鸭瘟病毒的基因编辑技术和鸭瘟病毒载体疫苗应用研究进展情况,以期为进一步研发鸭瘟病毒载体疫苗提供理论基础,同时也为新发传染病预防提供新策略。

大鼠VDAC1腺病毒过表达载体构建及功能鉴定

目的构建电压依赖性阴离子通道蛋白1(VDAC1)腺病毒过表达载体,并观察其在H9C2细胞中的表达情况,为探究VDAC1在心肌细胞缺血再灌注损伤中的作用机制奠定基础。方法构建ADV6-NC腺病毒及ADV6-VDAC1腺病毒,取第6代H9c2心肌样细胞用于转染。转染细胞分为3组:空白对照组、阴性对照组(转染ADV6-NC腺病毒)和实验组(转染ADV6-VDAC1腺病毒)。通过qPCR和蛋白免疫印迹实验检测各组细胞VDAC1的表达情况。结果成功构建ADV6-NC及ADV6-VDAC1,实验组的VDAC1表达量明显高于空白对照组和阴性对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论利用腺病毒载体可使H9c2细胞在体外持续高效表达VDAC1。

Uhrf1基因重组腺病毒载体构建及其在小鼠心肌细胞DNA损伤修复中的作用研究

目的:构建携带小鼠泛素样同源域和环指结构域1(Uhrf1)基因的重组腺病毒载体,验证Uhrf1基因在原代乳鼠心肌细胞中的表达情况,并探究其在过氧化氢(H_(2)O2)诱导的心肌细胞DNA损伤中的作用。方法:利用PCR扩增小鼠Uhrf1基因的编码序列,将其酶切后插入pADM-CMV-C-FH载体,获得重组腺病毒质粒ADM-Uhrf1。将该质粒转染至HEK293T细胞包装成重组腺病毒颗粒,数代扩增后进行腺病毒的纯化及滴度检测。分离25只1日龄ICR小鼠原代心肌细胞,分为两组,以感染复数(MOI)为50的比例分别感染ADM-Uhrf1及ADM-control(ADMCtrl),通过Western blot及免疫荧光染色验证重组腺病毒介导的UHRF1蛋白的表达,并利用H_(2)O2诱导心肌细胞DNA损伤,进而探究Uhrf1在DNA损伤修复过程中的作用。结果:通过壳蛋白免疫法检测得到的ADM-Uhrf1病毒滴度为1.8×10^(13) pfu/L。Western blot验证显示UHRF1蛋白表达水平显著升高(P<0.05),免疫荧光染色显示UHRF1主要表达在细胞核内,且Uhrf1的过表达能够显著抑制DNA损伤标志物磷酸化组蛋白H_(2)A变异体(γH_(2)AX)蛋白的表达(P<0.01)。结论:成功构建了携带小鼠Uhrf1基因的重组过表达腺病毒载体,并通过腺病毒递送系统在心肌细胞中实现了Uhrf1的过表达,且Uhrf1的过表达有效减轻了H_(2)O2诱导的心肌细胞DNA损伤。

构建CLDN18.2慢病毒载体及其稳转细胞株的建立

目的构建表达人紧密连接蛋白18.2(CLDN18.2)的慢病毒载体,并通过慢病毒转导293T细胞获得稳定表达CLDN18.2的293T稳转细胞株。方法采用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因,将其插入质粒pWPT,构建pWPT-CLDN18.2慢病毒包装质粒。采用PCR对重组质粒进行鉴定,对重组质粒进行慢病毒包装后转导293T细胞系,同时设立未转让质粒的293T细胞作为对照组,得到293T-CLDN18.2混合克隆细胞。检测转染后目的蛋白水平及单克隆细胞阳性率。结果经PCR鉴定,在700 bp处有一条清晰条带与目的基因大小相符。在25~35 kDa处有明显条带,与预期28.8 kDa相符。表达CLDN18.2单克隆细胞的阳性率为99.3%。结论该研究成功获得稳定表达人CLDN18.2的293T稳转细胞株,为下一步的单克隆抗体的制备奠定了基础。

病毒载体疫苗研究进展

近十年来,中东呼吸综合征、埃博拉出血热、寨卡病毒感染、新型冠状病毒肺炎等重大传染性疾病疫情相继出现,对疫苗的快速研发提出重大挑战。其中病毒载体疫苗是新型疫苗研发的重要形式,它可以通过雾化吸入或口服等方式进行无创免疫,在没有佐剂的情况下发挥免疫作用,同时诱导体液、细胞和黏膜免疫反应,具有良好的免疫原性和安全性。随着对病毒基因组和结构蛋白等元件认识的不断深入,利用合成生物学研究思路系统设计、改造病毒载体,从而赋予重组病毒载体疫苗高滴度生产、高安全性和高免疫原性等生物学特征,对疫苗研发具有重要指导意义。本文综述了复制型、非复制型等病毒载体疫苗研发策略,以及具有临床应用价值的疫苗病毒载体,如腺病毒载体、痘病毒载体、水疱性口炎病毒载体等,希望对利用合成生物学进行新型病毒载体疫苗的研发提供一定的参考。未来,病毒载体疫苗必将向着更高的安全性、更强的保护性、更好的依从性、更低的生产成本等方向迭代发展。

牦牛“海绵吸附”bta-miR-125b的lncRNA筛选验证及慢病毒载体构建

旨在筛选在牦牛卵泡发育过程中可能吸附bta-miR-125b的长链非编码RNA(lncRNA),并构建双荧光素酶载体与慢病毒过表达载体,为研究调控牦牛生殖相关lncRNA的功能及机制提供基础。利用miRanda与RNAhybrid数据库预测可能靶向牦牛bta-miR-125b的lncRNAs,筛选出bta-miR-125b具有“海绵吸附”作用的lncRNAs,由RNAhybrid进行结合位点预测,筛选出最优的lncRNA;采集牦牛卵巢分离卵泡并提取总RNA构建cDNA池,以RT-PCR技术扩增筛选所得lncRNA;在此基础上利用pmir-GLO载体构建技术构建该lncRNA野生型及突变型双荧光素酶报告载体,并将其与bta-miR-125b mimics共转染至293T细胞,检测双荧光素酶活性;最后利用慢病毒载体构建技术将测序正确的lncRNA与pHBLV-CMV-MCS-EF1-ZsGreen-T2A-puro载体同源区的片段同源重组,通过慢病毒包装系统(psPAX2:pMD2G)包装后感染293T细胞,计算感染效率及滴度。结果:两个数据库中的lncRNA-ARS-UCD1.2与bta-miR-125b存在紧密结合位点,扩增出lncRNA-ARS-UCD1.2的序列全长为1552 bp;双荧光素酶活性检测表明牦牛lncRNA-ARS-UCD1.2与bta-miR-125b mimic具有靶向关系(P<0.01);同源重组后经酶切鉴定及测序验证表明成功构建了重组质粒,感染效率达(61.520±0.875)%,感染滴度为4×10^(8)TU/mL,表明lncRNA-ARS-UCD1.2过表达慢病毒载体成功构建。综上,本试验筛选出牦牛“海绵吸附”bta-miR-125b的lncRNA,并验证了两者的靶向结合关系,同时成功构建了该lncRNA的过表达慢病毒载体,为下一步深入研究lncRNA在细胞中的功能机制奠定了基础。

采用慢病毒载体干扰TRAF2表达的MH7A细胞稳转株的构建及意义

目的 用慢病毒载体构建干扰肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)表达的类风湿关节炎(RA)患者滑膜细胞株MH7A细胞稳转株,研究TNF-α-TRAF2信号在MH7A异常增殖的作用。方法 根据人TRAF2的基因序列和shRNA序列设计原则,设计并合成3对TRAF2-shRNA干扰序列,通过PCR对引物进行退火,通过双酶切PLKO.1-puro获得线性载体,将线性化载体与退火后引物通过Solution I连接,连接产物导入感受态细胞,涂板,挑取阳性菌落进行测序。构建3种不同的PLKO.1-TRAF2-shRNA慢病毒重组质粒,借助慢病毒包装质粒对对数生长期的HEK 293T细胞进行慢病毒包装,收集病毒液感染MH7A细胞,同时使用嘌呤霉素对TRAF2低表达的MH7A稳转株进行筛选。使用CCK-8法、Western blot、qPCR检测MH7A中肿瘤坏死因子TNF-α诱导TRAF2低表达的MH7A增殖功能及下游信号TRAF2、P65蛋白表达和mRNA水平。结果 成功构建了PLKO.1-TRAF2-shRNA(1)、PLKO.1-TRAF2-shRNA(2)和PLKO.1-TRAF2-shRNA(3)慢病毒载体质粒和对照组慢病毒载体质粒PLKO.1-puro,将3个TRAF2-shRNA慢病毒载体质粒和对照组慢病毒载体质粒PLKO.1-puro分别与慢病毒包装质粒导入HEK 293T获得病毒液,将病毒液感染MH7A细胞后,经嘌呤霉素(2.00μg/ml)筛选,2 d得到MH7A稳转株;qPCR和Western blot结果显示,PLKO.1-TRAF2-shRNA(1) MH7A细胞稳转株中TRAF2 mRNA和蛋白的表达较阴性对照组明显下降;CCK-8和Western blot结果表明,MH7A中TRAF2敲低后,TNF-α诱导的TRAF2低表达的MH7A细胞增殖和P65的磷酸化水平明显下降。结论 成功构建了PLKO.1-TRAF2-shRNA(1) MH7A细胞稳转株,研究TNF-α-TRAF2信号活化介导RA滑膜细胞异常增殖中的作用。

虹鳟传染性造血器官坏死病-传染性胰腺坏死病重组腺病毒载体的构建

传染性造血器官坏死病和传染性胰腺坏死病是以感染鲑科鱼类为主的两种传染病。为克隆传染性造血器官坏死病病毒IHNVG基因和传染性胰腺坏死病病毒IPNVVP2基因,并构建其重组腺病毒载体。利用RT-PCR方法分别扩增出IHNVG基因和IPNVVP2基因,通过多基因片段同源重组技术将IHNVG基因和IPNVVP2基因克隆到pAdTrack-CMV载体上,经过线性化后与pAdEasy-1载体在BJ5183菌体内同源重组,构建出重组腺病毒质粒,经PCR及NotⅠ和HindⅢ双酶切鉴定后,再经PacⅠ线性化后用于转染HEK-293细胞,获得重组腺病毒。通过绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表达来监控重组腺病毒的复制情况,用western blot法分别检测糖蛋白(G蛋白)和VP2蛋白的表达,并测定重组病毒的滴度。结果显示,克隆出的IHNVG基因和IPNVVP2基因总长度为3036 bp。该病毒在HEK-293细胞中分别表达出蛋白分子质量约为58 kD和54 kD的产物,其滴度为1.0×10^(9.5)mL^(-1)TCID_(50)。结果表明,研究成功获得IHNVG基因和IPNVVP2基因重组腺病毒,该病毒在HEK-293细胞中滴度较高,能够稳定表达。研究结果为下一步研发传染性造血器官坏死病-传染性胰腺坏死病二联疫苗奠定了基础,并为进一步防控传染性造血器官坏死病和传染性胰腺坏死病提供了参考。

植物RNA作为载体RNA在病毒核酸提取过程中的保护效果研究

目的探究植物RNA作为载体RNA在病毒核酸提取过程中对目标核酸的保护效果。方法分别提取绿萝、水稻、竹子3种常见植物中的RNA作为载体RNA,同时以商业试剂Takara载体RNA为对照,提取甲型流感病毒(Flu A)、乙型流感病毒(Flu B)、呼吸道合胞病毒A型(RSV A)核酸,并利用实时荧光定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)定量分析提取得到的病毒核酸浓度,以评估植物RNA在核酸提取中对病毒核酸的保护效果。结果经琼脂糖凝胶电泳检测,所提取植物RNA的28S rRNA、18S rRNA条带清晰明亮,无弥散现象,所得RNA具有良好的完整性。且经验证,植物RNA对病毒核酸扩增无干扰。裂解液中分别加入0、1000、3000、5000、7000、9000 ng绿萝RNA进行Flu A RNA提取时,提取物经RT-qPCR扩增后的Ct值分别为35.06±0.14、33.01±0.42、32.45±0.33、31.95±0.34、31.74±0.28、31.92±0.24,使用Takara载体RNA提取核酸的Ct值为31.96±0.34。Ct值随着绿萝RNA添加量增加而降低,当添加量≥5000 ng时,Ct值接近使用Takara载体RNA的提取组,继续提高绿萝RNA用量,Ct值趋于稳定,且与使用TaKaRa载体RNA的Ct值比较,差异无统计学意义(P>0.05)。添加5000 ng绿萝RNA与添加0 ng绿萝RNA相比,Ct值相差3.11,根据浓度差等于2ΔCt计算可知添加5000 ng绿萝RNA提取得到的Flu A核酸浓度比不添加载体RNA高了8.63倍。进一步研究发现,添加绿萝RNA、水稻RNA、竹子RNA及Takara载体RNA,提取得到的Flu A、Flu B和RSV A核酸经RT-qPCR扩增后得到的Ct值与不添加载体RNA比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。绿萝RNA作为载体RNA在提取Flu A、Flu B、RSV A混合病毒核酸时,对比无载体RNA的对照组,分别降低了2.61、2.90、1.45个Ct值,即添加了绿萝RNA后提取Flu A、FluB、RSV A所得的核酸浓度分别提高了6.11、7.46、2.73倍。且添加了水稻RNA和竹子RNA提取混合病毒核酸所得的核酸浓度也分别至少提高了2.63倍和2.60倍。结论在病毒核酸提取过程中植物RNA具有保护病毒核酸的作用,可以提高提取得到的目的病毒RNA浓度,可用作病毒核酸提取时的载体RNA,为核酸提取中的载体RNA选择提供更多来源。

基于病毒载体的神经病理性疼痛靶向基因治疗

神经病理性疼痛(neuropathic pain,NP)是由躯体感觉系统的损害或疾病导致的疼痛,严重影响病人的生理和心理健康。但目前的治疗效果往往并不理想。基因治疗是一种新兴的治疗策略,在诸多研究中已经证实病毒载体介导的基因治疗能够缓解NP。因此,本文根据NP的病理生理机制作为理论依据,讨论了基于病毒载体缓解NP的基因治疗,并对不同靶点的基因治疗进行归纳。对未来NP的研究方向提供了有益的参考和治疗思路。

猪流行性腹泻病毒Nsp7基因真核表达载体的构建及表达

PEDV Nsp7蛋白是猪流行性腹泻病毒的一种非结构蛋白,它在病毒复制过程中表达,并与感染细胞的内质网和细胞膜相关,是病毒基因组翻译的两个大型复制酶的关键辅助因子。为了对PEDV Nsp7蛋白进行更加深入的研究,试验从病变猪小肠中提取总RNA,并通过RT-PCR扩增获取PEDVNsp7基因,最终将其连接到pCMV-Myc载体上。试验结果显示,成功构建了pCMV-Myc-Nsp7的重组质粒,并通过Western Blot技术和免疫荧光技术在真核细胞中验证了其蛋白表达情况,为后续研究PEDV Nsp7的生物学功能奠定了良好的基础。

C5orf34基因过表达慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建C5orf34基因的过表达慢病毒载体。方法通过聚合酶链反应(PCR)选择性扩增C5orf34基因目的片段,将目的片段连接至载体,利用基因重组技术构建带有C5orf34基因目的片段的重组载体,将重组载体转化到感受态细胞扩增并对阳性克隆的C5orf34过表达慢病毒载体进行测序,将正确重组的过表达慢病毒载体包装并转染色至293T细胞进行后续的慢病毒转染和滴度测定,采用实时定量PCR法检测C5orf34基因的过表达水平。结果经过测序比对显示,慢病毒载体与设计参考序列一致。重组慢病毒经包装并转染293T细胞后可观察到荧光,显示C5orf34过表达慢病毒载体滴度为1.0×10^(8)TU/mL。实时定量PCR的结果显示,在稳定转染C5orf34基因的细胞中C5orf34基因表达水平明显增高。结论成功构建C5orf34基因过表达慢病毒载体,为进一步研究C5orf34基因在肺癌发生发展过程中的机制奠定了生物学基础。

结核病病毒载体疫苗研究进展

结核病(TB)由结核分枝杆菌感染引起,其发病率和死亡率在传染性疾病中均居于前列,而疫苗是有效控制TB的重要因素。鉴于卡介苗(BCG)对成年人TB预防效果有限,新型TB疫苗(尤其是病毒载体疫苗)意义重大。该文拟对TB病毒载体疫苗的类型、效力及其研究进展做一综述。

p62基因过表达慢病毒载体的构建及表达

目的构建p62基因过表达慢病毒载体及其表达系统,并在人单核细胞白血病细胞(THP-1)中稳定表达,为在细胞水平研究p62基因的作用提供途径与方法。方法采用聚合酶链式反应(PCR)扩增p62基因片段,将扩增产物连接至线性化pcDNA3.1-Flag-PCDH10真核表达慢病毒载体;PCR鉴定重组质粒,将构建成功的重组质粒和包装质粒共转染至人胚胎肾细胞293(HEK 293T);用重组慢病毒感染人单核细胞白血病(THP-1)细胞,氨苄霉素筛选阳性细胞克隆株;Western blot和实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测高表达p62基因的THP-1细胞株(过表达组)和转染不含p62基因空质粒(对照组)的THP-1细胞株;感染肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae,K.p.)后,RT-qPCR检测THP-1细胞中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β和趋化因子1(Cxcl1)表达水平。结果通过PCR成功获得p62基因片段并连接到pcDNA3.1-Flag-PCDH10病毒载体上,并且PCR检测显示p62-pcDNA3.1-Flag-PCDH10重组质粒构建成功;挑选慢病毒感染THP-1细胞后抗氨苄青霉素细胞株,Western blot检测结果显示药筛存活的THP-1细胞较对照组细胞P62蛋白表达增多(P<0.001),且RT-qPCR检测显示p62 mRNA表达增高(P<0.001),说明成功构建高表达P62蛋白的THP-1细胞株;感染K.p.后,高表达P62的THP-1细胞中TNF-α、IL-1β和Cxcl1表达水平增高(P<0.01)。结论经三质粒包装系统可以成功构建p62-pcDNA3.1-Flag-PCDH10慢病毒载体及高表达P62蛋白THP-1细胞株,为后续p62基因的研究提供了基础。