应用AdMax载体系统构建SCL基因重组腺病毒表达载体

目的用AdMax载体系统构建人SCL基因重组腺病毒载体,为研究SCL基因对ICC样细胞功能恢复奠定基础。方法采用PCR方法从含人SCL基因质粒中扩增SCL基因,连接到腺病毒穿梭质粒的多克隆位点上,构建重组穿梭质粒pDC315-EGFP/SCL,在脂质体介导下与腺病毒辅助大质粒pBHGlox(delta)E1、3Cre共转染293细胞,包装产生复制缺陷型重组腺病毒pDC315-SCL经HEK293细胞扩增,纯化后测定病毒滴度。结果 PCR结果和Western blotting检测证实pDC315-SCL重组腺病毒载体构建成功,滴度达到1×1010PFU/mL。结论 AdMax载体系统可成功构建pDC315-SCL重组腺病毒载体。

经尿道灌注SCL基因重组慢病毒的DCP豚鼠膀胱Cajal样间质细胞数量、分布及超微结构观察

目的观察经尿道灌注干细胞白血病(SCL)基因重组慢病毒的糖尿病膀胱病(DCP)豚鼠膀胱Cajal样间质细胞(ICC)的数量、分布及超微结构变化。方法构建SCL基因重组慢病毒且标定滴度。选择雄性豚鼠70只,单次腹腔注射链尿佐菌素12周后构建DCP豚鼠模型,将成功造模的27只豚鼠随机分为实验组、阳性对照组、空白对照组,每组9只。实验组、阳性对照组、空白对照组豚鼠分别经尿道灌注(转染)SCL基因重组慢病毒、空慢病毒和等量PBS液。分别于转染后7、14、28 d每组各处死3只豚鼠,取膀胱组织,制作切片,激光共聚焦显微镜下观察GFP表达、膀胱ICC数量及分布变化,透射电镜下观察膀胱ICC的超微结构变化。结果实验组随转染时间延长,ICC数量逐渐增多(P均<0.01),分布越发密集,但绿色荧光逐渐减退;空白组和对照组未见绿色荧光,随转染时间延长,ICC数量逐渐减少(P均<0.05),分布稀疏;转染14、28 d时,实验组ICC数量较空白组和对照组增加(P均<0.01)。实验组随转染时间延长,ICC细胞器数量增多,形态趋于正常,细胞内空泡减少,胞周突起延长变多,ICC超微结构处于不断恢复之中;而阳性对照组和空白对照组ICC超微结构病理变化逐渐加重。结论经尿道灌注SCL基因重组慢病毒转染DCP豚鼠膀胱后,膀胱ICC数量增多,分布更加密集,细胞超微结构得到修复,提示SCL基因对DCP可能有一定治疗效果。

SCL基因在白血病和正常骨髓基质细胞中的表达

目的 初步了解干细胞白血病 (SCL)基因在白血病和正常骨髓基质细胞中的表达情况 .方法 通过长期体外培养扩增骨髓基质细胞 ,运用RT -PCR -ELISA检测SCL基因的表达 .结果 SCL表达于绝大多数CML、AML、CLL患者骨髓基质细胞中 ,部分正常骨髓基质细胞也表达SCL基因 .

SCL基因在干细胞疾病中的表达

SCL基因位于1号染色体短臂（1P34）（又称TAL－1或TCL－5），编码一种螺旋－环－螺旋类的转录因子，其功能与造血细胞生长调节、分化发育、白血病的发生有关。应用RT／PCR的方法，检测了ALL、ANLL和CML65例病人白血病细胞，31例骨髓增生异常综合征、41例再生障碍性贫血症和25例正常人外周血单个核细胞中SCL基同的表达情况，表达率分别为54．5％、60．9％、55．0％、35．5％、0％和0％。SCL基因在恶性干细胞疾病ALL、ANLL、CML和MDS中的高表达现象，提示该基因与白血病或恶性干细胞疾病的发生有一定的关系。

人SCL基因pDC315-EGFP真核表达载体的构建及意义

目的构建含有人SCL基因的pDC315-EGFP真核表达载体,为糖尿病膀胱病变(DCP)的治疗提供新思路。方法从含有人SCL基因的质粒中,采用PCR方法扩增SCL基因,将目的载体pDC315-EGFP进行酶切后交换,其产物转化细菌感受态细胞,对克隆产物进行菌落PCR鉴定,对阳性克隆产物进行测序和比对分析,比对正确的克隆即为构建成功的质粒。结果 PCR扩增的基因片段长度为1 036 bp,测序结果以及重组质粒pDC315-EGFP-SCL阳性克隆凝胶电泳鉴定均证明SCL基因成功克隆到真核表达载体中。结论成功构建了真核表达载体pDC315-EGFP-SCL,该载体有望用于DCP的治疗。

SCL基因在白血病患者骨髓基质细胞中的表达

为了解白血病干细胞 (stemcellleukemia ,SCL)基因在白血病骨髓基质细胞 (BMSC)及骨髓细胞中的表达情况 ,收集 18例急性髓系白血病 (AML)、17例慢性粒细胞白血病 (CML)、7例急性淋巴细胞白血病 (ALL)和 33例正常骨髓标本的单个核细胞 (MNC)进行体外长期培养 ,分别收集悬浮细胞 (造血细胞 )和扩增后的贴壁细胞 (BMSC)。运用RT PCR ELISA检测SCL基因的表达 ,分析表达率 ,并以管家基因 β2 微球蛋白 (β2 M)为内参照进行半定量分析。结果发现 ,SCL基因在AML(2 7.8% )和CML(11.8% )的BMSC中的表达率均低于正常对照组 (6 9 7% ,P <0 .0 5 )。SCL基因在CML骨髓造血细胞中的表达率 (6 4 .3% )高于其对应的BMSC(P <0 .0 5 )。半定量分析SCL基因在AML骨髓造血细胞中的表达水平显著高于其对应的BMSC(P <0 .0 5 )。结论 :SCL基因在AML和CML的BMSC中的相对低表达状态可能与血液病造血调控的异常有关。

木薯SCARECROW-LIKE(SCL)基因克隆、生物信息学及非生物胁迫下表达分析

【目的】克隆木薯SCARECROW-LIKE(MeSCL)基因,对其进行生物信息学分析,并检测其在非生物胁迫下的表达情况,为深入研究木薯MeSCL基因响应非生物胁迫的调控机制提供理论参考。【方法】以木薯品种D346为材料,采用RT-PCR克隆MeSCL基因编码区(CDS)序列,并利用生物信息学分析软件进行序列特征分析,采用实时荧光定量PCR检测其在干旱、盐、氧化和低温胁迫下木薯叶片中的表达情况。【结果】克隆获得的MeSCL基因编码区(CDS)序列全长1655 bp,与参考序列(GenBank登录号LOC110627921)仅存在2个碱基的差异,开放阅读框(ORF)的长度为1560 bp,编码519个氨基酸,编码蛋白分子量为57.84 kD,等电点(pI)为6.08,脂肪系数为80.46%,总平均亲水性指数为-0.195,为亲水性蛋白,含有1个信号肽、6个从内部到外部的跨膜螺旋区和5个从外部到内部的跨膜螺旋区,定位于细胞核和内质网中,属于GRAS蛋白家族成员,具有该家族的保守结构域。MeSCL蛋白三级结构模型显示,该蛋白含有14个典型的α螺旋、10个β-折叠和36个β-转角。MeSCL蛋白与橡树HbSCL蛋白的相似性最高,为90.80%,与蓖麻RcSCR、胡杨PeSCL、毛果杨PtSCR、可可树Tc SCR和哥伦比亚锦葵HuSCL蛋白的相似性在80.00%左右。MeSCL基因受干旱、盐、氧化和低温胁迫诱导表达量整体呈升高趋势,但在不同处理时间的表达量存在明显差异,其中,干旱和氧化胁迫下,MeSCL基因均在处理24 h时表达量最高,分别是对照的6.05和11.17倍,而盐和低温胁迫下,MeSCL基因均在处理6 h时表达量最高,分别是对照的11.76和3.80倍。【结论】MeSCL基因参与木薯植株的非生物胁迫响应,正向调控其抗非生物胁迫能力。

经尿道灌注SCL基因重组慢病毒对DCP膀胱收缩功能影响的研究

目的:本研究采用基因重组的慢病毒液灌注糖尿病膀胱病变(DCP)豚鼠膀胱的方式,观察其对膀胱逼尿肌收缩功能的影响。方法:建立DCP豚鼠模型,将DCP模型随机分为实验组、阳性对照组和空白对照组,实验组灌注SCL基因重组慢病毒液;阳性对照组灌注未携带SCL基因的慢病毒+PBS液;空白对照组只灌注PBS液;检测灌注后对各组豚鼠逼尿肌收缩功能的影响。结果:实验组中灌注后随时间的延长,逼尿肌收缩功能有所恢复,空白组和阳性对照组灌注后,逼尿肌的收缩功能均无明显改善。结论:经尿道灌注SCL基因(人类干细胞白血病基因)重组慢病毒转染DCP膀胱后,豚鼠的膀胱逼尿肌收缩功能较前有所改善,提示该方法对DCP具有疗效,为DCP行基因治疗提供了依据。

scl原癌基因表达产物对造血调控作用的研究进展

scl基因编码一个碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子,属bHLH家族。该家族的成员对多种细胞系或组织的发生和发育有调控作用。scl基因的最初发现是因为在肿瘤细胞中有其重排。在人T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)中scl发生突变,scl在小鼠T淋巴细胞株表达使细胞转化,这些表现强烈地提示它是T细胞的原癌基因。目前人和鼠的scl基因均已被克隆。scl基因产物的几种蛋白中两个主要研究对象是磷酸蛋白PP24和PP42,它们可能有反式激活特性。SCL蛋白表达于原始的多系祖细胞及红系、巨核系和肥大细胞系的定向祖细胞。SCL对造血细胞增殖和分化的调控有赖于细胞在分化途径所处的阶段。scl的突变是负显性突变。新近证实SCL基因产物是造血干细胞分化的一个关键调节蛋白,为所有造血细胞系发育所必需。无scl基因的ES细胞不能产生任何类型造血细胞,包括T和B细胞。剔除scl基因所产生的结果是特有的,它完全取消了所有细胞系及其祖细胞的产生。SCL蛋白可能通过与bHLH家族其它成员或RBTN2、GATA等其它转录因子形成异聚体复合物,借以同靶启动子的“E盒”结合,调节正常造血细胞和T细胞生瘤过程。

姜黄素对皮肤鳞状细胞癌SCL-1细胞的去甲基化作用研究

目的观察姜黄素作用于皮肤鳞状细胞癌SCL-1细胞后E-cadherin和p14ARF基因甲基化状态及基因表达的改变情况,为姜黄素的临床应用提供理论依据。方法用不同浓度(10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L)的姜黄素处理皮肤鳞癌细胞株SCL-1,MTT法检测细胞增殖情况,甲基化特异性PCR(MSP)法检测E-cadherin和p14ARF基因甲基化状态的改变,RT-PCR法检测E-cadherin和p14ARF基因的表达情况。结果姜黄素可抑制SCL-1细胞的增殖,且呈现时间-剂量依懒性;当姜黄素浓度增至40μmol/L时,SCL-1细胞的E-cadherin和p14ARF基因甲基化减弱、表达增强。结论姜黄素可明显抑制SCL-1细胞增殖,适当浓度的姜黄素对SCL-1细胞的E-cadherin和p14ARF基因有一定的去甲基化作用,并可以调控E-cadherin和p14ARF基因的表达。

SCL基因在急性白血病患者中的表达及其意义

目的 :探讨 SCL 基因在急性白血病患者中的表达及其临床意义。方法 :应用 RT-PCR方法对 110例急性白血病患者不同时期 12 7份外周血标本中 SCL 基因的表达进行检测。结果 :在初治 /复发期、完全缓解期 (缓解时间 <6月 )及完全缓解后期 (缓解时间 >2年 )急性白血病中 SCL基因表达阳性率分别为 6 5 .9%、5 6 .3%及 2 0 .0 % ,在初治 /复发期与完全缓解后期间差异有显著性(P<0 .0 5 )。正常人外周血未检测到 SCL 基因表达。结论 :大多数急性白血病表达 SCL 基因 ,SCL 基因在急性白血病的发生中可能起一定的调节作用 。

SCL/TAL1中断基因座对膀胱癌增殖和迁移的影响及其作用机制

目的:探讨SCL/TAL1中断基因座(STIL)的表达对膀胱癌增殖和迁移的影响及其作用机制。方法:在Timer和UALCAN数据库中分析STIL在膀胱癌中的差异表达和分期。在T24细胞系中使用CRISPR/Cas9技术导入单链向导RNA(sgRNA)敲除STIL。设置组别为T24细胞株对照组和稳定敲除STIL实验组的T24细胞株(6#、30#)。通过细胞计数试剂盒(CCK-8)实验、平板克隆形成实验、Transwell实验和软琼脂克隆实验观察STIL对膀胱癌的增殖和迁移的影响。通过免疫荧光实验检测细胞增殖标志物细胞核增殖抗原(Ki-67)和5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(EDU)验证敲除STIL抑制膀胱癌细胞的增殖。转录组测序技术(RNA-seq)和基因富集分析(GSEA)寻找STIL的相关信号通路。通过蛋白质印迹法(Western blot)实验观察STIL对实验观察STIL对细胞外信号调节激酶(ERK)、磷酸化ERK(p-ERK)、周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)、细胞周期蛋白(Cyclin)B1的影响。组间比较采用独立样本t检验。结果:生信数据库发现STIL在多种癌症中高表达,其中包括膀胱癌,肿瘤组织组中STIL的表达高于正常组织组[4.411(2.322~7.133)比0.659(0.312~0.892),P<0.05]。STIL的表达与膀胱癌的分期显著相关。在敲除STIL后,CCK-8实验[对照组光密度明显高于敲除组(2.76±0.17比1.11±0.11),t=19.865,P<0.05和(2.76±0.17比1.30±0.17,t=14.720,P<0.05]、平板克隆形成实验结果显示,对照组集落数明显高于敲除组[(77.67±9.50)比(18.67±4.04),t=9.895,P<0.05]和[(77.67±9.50)比(20.67±3.79),t=9.650,P<0.05]、Transwell实验结果显示,对照组迁移细胞数明显高于敲除组[(171.00±13.53)比(56.33±13.5),t=10.391,P<0.05]和[(171.00±13.53)比(23.33±9.29),t=15.585,P<0.05],软琼脂克隆实验结果显示,对照组细胞数明显高于敲除组[(168.67±11.02)比(48.33±5.03),t=17.210,P<0.05]和[(168.67±11.02)比(23.33±5.69),t=20.307,P<0.05]。免疫荧光实验示,对照组Ki-67明显高于敲除组[(0.273±0.014)比(0.088±0.012),t=16.870,P<0.05]和[(0.273±0.014)比(0.022±0.007),t=27.505,P<0.05],对照组EDU明显高于敲除组[(0.379±0.026)比(0.054±0.01),t=20.248,P<0.05]和[(0.379±0.026)比(0.042±0.007),t=21.802,P<0.05]。RNA-seq和GSEA显示STIL与ERK通路显著相关(P<0.05)。Western blot实验显示,p-ERK、CDK1、Cyclin B1下降。结论:STIL在膀胱癌中表达上调,敲除STIL能抑制膀胱癌细胞增殖和迁移,ERK、CDK1、Cyclin B1等细胞周期相关基因可能是其作用机制之一。