葡萄无核基因定位与作图的研究

以UBC 269484和GSLP1569的序列为支点,设计合成了包括UBC 269和GSLP1在内的9条引物,以葡萄 有核亲本红地球和无核亲本红光无核的DNA为模板,对这9个引物进行筛选,结果GSLP1、39970524 5号引物和 39970524 6号引物在无核亲本红光无核上扩增出了特异标记GSLP1569、39970524 5 564、39970524 6 1538和 39970524 6 1200。用这3个特异引物在红地球、红光无核、无核白和红地球×红光无核杂交组合F1代163株杂 种的DNA样上进行PCR扩增,结果4个特异标记在F1群体中与无核主效基因共分离。4个特异标记也出现于所 用组合中无核基因原始供给者无核白上。这些标记和葡萄无核主效基因相连锁。用QTXb17遗传作图软件,对葡 萄无核主效基因S定位与作图,当P=0.01时,LOD值在32.7～46.4之间,置信界限在0.2～9.9之间。这4个 特异标记和无核主效基因S处于在同一连锁群,位于无核主效基因S的两侧,覆盖基因组12.3cM。特异标记 39970524 5 564、GSLP1569、39970524 6 1538、39970524 6 1200距S基因的遗传距离分别为0.6cM、1.2cM、 4.9cM和11.1cM。

用DNA探针检测我国栽培的无核葡萄及辅助育种初探

用葡萄无核基因的特异探针 18bp (5’CCAGTTCGCCCGTAAATG3’)检测了我国栽培的 2 1个无核葡萄品种和 9个有核对照品种的无核性 ,证实了该探针可以对葡萄无核基因进行准确的检测和鉴定 ;通过该探针对有核×无核 (红地球×红光无核 )杂交后代无核性状的鉴定 ,并对照大田结果 ,证明了 18bp检测葡萄无核基因探针具有预测葡萄无核性状的作用。

葡萄无核基因SCAR标记的序列构成与酶切分析

利用葡萄无核基因的特异探针１８ｂｐ,通过ＰＣＲ扩增获得了与葡萄无核基因相连锁的ＳＣＡＲ标记约５９０ｂｐ,采用自动荧光ＤＮＡ测序仪对该片段的核苷酸组成进行双向测序,来自无核白的无核基因特异标记由５６９对核苷酸组成。该标记可以作为合成探针和设计特异引物进行ＰＣＲ扩增的基础,用于检测葡萄育种材料和无核品种的无核性。

葡萄无核基因的SCAR标记及Southern blot分析

根据无核基因特异RAPD标记的序列进行分析,合成1对特异引物P1+P3(序列分别是P1:5′CTCATCTTCTTGATGGTGAT3′;P3:5′AAGTGAAGAACATCATTAAGAAC3′),对30个葡萄材料进行PCR扩增,成功地将RAPD标记转换成SCAR标记。并对含有该标记序列的重组质粒进行Hind 和Spe 双酶切,获得的310bp片段回收后制成探测葡萄无核基因存在与否的杂交探针,成功地对7个葡萄品种进行Southernblot分析,实现了分子标记检测葡萄无核基因的目的。

转基因技术生产无籽果实的新策略

无籽果实具有许多优点 ,深受人们喜爱。传统无籽果实生产方法存在着诸如单性结实品种少、外用激素施用量不易掌握及四倍体品种较难获得等一系列问题。分子遗传研究表明 ,植物基因组中含有影响单性结实的基因 ,某些来自于细菌的基因也可在植物激素生物合成途径中起调节作用。应用这些目的基因 ,已建立了转基因生产无籽果实的新策略 ,如在种皮或子房特异性启动子控制下的生长素基因或细胞毒素基因的表达及“终止子”技术的运用等 ,这将大规模地促进蔬菜和水果生产 ,提高果蔬产品的市场价值。

检测葡萄无核基因DNA探针的合成与应用

利用细菌质粒 M13克隆葡萄无核基因的 RAPD标记 UBC- 2 6 94 50 后 ,采用自动荧光 DNA序列分析仪对其测序。结果表明 ,UBC- 2 6 94 50 由 4 84对核苷酸及其特定序列构成。按照该序列 ,人工合成两个寡聚核苷酸5′ CCAGT TCACT CTCAA TAGGT CC3′和 5′ CCAGT TCGCC CGTAA ATG3′分别作引物 ,当用获得该标记及其序列的亲本和无核杂种后代作模板进行 PCR分析 ,凡是可以扩增出约 5 90 bp片段即为无核基因携带者和表达者。进一步用其原始无核祖先无核白和商业化无核品种及 C78- 47× B52 - 1 2 2 杂交组合后代做模板进行 PCR扩增 ,凡出现约 5 90 bp的特殊标记即为无核基因携带者和无核性状表达者。研究结果证明 ,18bp寡聚核苷酸 5′ CCAGTTCGCC CGTAA ATG3′具有检测葡萄无核基因的探针作用 ,定名为检测葡萄无核基因的探针 1号 (GSL P1)。

葡萄无核基因的RAPD遗传标记

报道了用随机引物和混合分离分析（ＢＳＡ）方法检测葡萄无核基因连锁的遗传标记。ＤＮＡ混合样来自Ｂ７２－２１６×Ｂ４５－１８７的杂交后代。两个混合样分别由９个表现型为无核和有核杂种组成，除有核与无核性状外，其他性状是随机的。用１０碱基随机序列的１００个引物筛选混合样以期获得多态型ＤＮＡ片段。结果在引物ＵＢＣ－２６９扩增后，５００对碱基的ＤＮＡ多态型片段出现在无核样，而有核样不出现该多态型片段。进一步用杂种、父本及其无核基因的供给者无核白（ＴｈｏｍｐｓｏｎＳｅｅｄｌｅｓｓ）和百乐葡萄（Ｐｅｒｌｅｔｅ）作模板，用引物ＵＢＣ－２６９扩增，一些杂种、亲本及无核基因的供给者也拥有５００对碱基的多态型片段。据此分析，葡萄的无核性是由多基因控制的，这些基因有主效和微效之分；本研究获得的分子标记ＵＢＣ－２６９５００与葡萄无核基因之一有连锁关系。

葡萄无核基因的研究进展

综述了无核葡萄的类型与无核基因的利用,利用葡萄无核基因选育无核葡萄的技术,葡萄无核基因的遗传模型,无核基因的分子标记以及相关基因的克隆等研究进展。

无核荔枝花发育相关MADS-box基因的克隆及结构分析

目的:克隆与无核荔枝花发育相关的MADS-box基因。方法:根据多种植物的MADS-box保守区及其C-端序列设计一对简并性引物,利用RT-PCR及3’-RACE的方法分离目的基因。结果:经同源分析,所克隆到的基因的cDNA序列包含有完整的MADS-box保守区与半保守的K区,是典型的MADS-box家族基因,命名为LMADS1。结论:成功地克隆到一个与无核荔枝花发育相关的MADS-box基因,以便进一步研究其对无核荔枝花发育的调控作用。

关于无籽果实利用的研究

介绍了在水果蔬菜中 ,传统无粒果实的生产方法 ,探讨了利用转基因技术生产无粒果实的新方法 .

无核荔枝MYB转录因子基因克隆及进化分析

为获得在无核荔枝中胚珠退化过程中差异表达全长MYB转录因子基因,并为其功能研究打下基础,根据从已构建的无核荔枝胚珠败育SSH消减文库中得到的差异表达的MYB转录因子EST序列,提取高质量的总RNA,运用SMART RACE技术,获得一个1177bp的MYB基因核苷酸序列。生物信息学分析表明,该序列含有879 bp的开放阅读框,推测的蛋白质为292个氨基酸,具有2个SANT结构功能域,在系统发育树上与大豆MYB基因亲缘关系最近。该基因为MYB基因家族中的新成员。

无核白葡萄脱水素等位基因的克隆及序列分析

以欧洲葡萄无核白品种(Vitis vinifera cv.Thompson Seedless)为研究材料,根据霞多丽品种脱水素基因序列设计引物并PCR扩增。PCR产物用地高辛标记并Southern杂交分析,发现无核白基因组含有2个不同的脱水素基因。设计并采用一种基于对琼脂糖凝胶梯状切割回收的方法克隆这2个不同脱水素基因的DNA片段,分别命名为DHN1-L和DHN1-S。进一步用反向PCR法获得这2个脱水素基因DNA片段的侧翼序列,获得基因DNA全长序列(NCBI登录号分别为EF371882和EF371881)。与已公布葡萄基因组序列比对,这2个基因位于第4号染色体相同位置,为等位基因,说明无核白品种脱水素基因为杂合体。2个脱水素基因所翻译蛋白在疏水性及三级结构方面有差异。无核白葡萄脱水素基因等位基因DNA序列的获得为进一步分析等位基因变异对植物抗逆性的影响提供了依据。

三倍体无籽西瓜果实发育期番茄红素合成代谢酶基因的表达

【目的】探讨红瓤、黄瓤无籽西瓜果实在不同发育时期番茄红素的积累差异、合成关键酶基因PSY、PDS、ZDS、CRTISO、LCYb的表达差异。【方法】选择无籽西瓜品种‘蜜枚’(红瓤)、‘黄枚’(黄瓤)为试材,采用分光光度计法和实时荧光定量PCR技术分别对果实发育过程中番茄红素的积累以及合成途径关键酶基因的表达进行分析。【结果】(1)‘蜜枚’番茄红素含量随着果实的发育逐渐升高,在授粉后35 d时达到最高;而‘黄枚’番茄红素积累量很少,在发育过程中一直处于较低水平。(2)2种瓤色无籽西瓜PSY基因的最高表达量都出现在授粉后25 d,从25 d开始PSY的表达量一直远高于其他基因,红瓤无籽西瓜LCYb基因的表达量一直处于最低水平,而黄瓤无籽西瓜LCYb基因的表达量仅低于PSY,高于其他3个基因的表达量。【结论】授粉后25 d可能是番茄红素积累的关键时期,番茄红素合成途径上游的PSY基因和控制分解的LCYb基因在番茄红素合成中可能起着较为重要的作用,而LCYb基因对瓤色起着重要的作用。

无核白及红地球葡萄VvMADS46基因的克隆及其无核调控功能分析

【目的】探究VvMADS46与葡萄无核性状产生的关系。【方法】采用实时荧光定量PCR分析VvMADS46在葡萄不同组织器官的表达,分析克隆VvMADS46基因序列,构建系统发育树,进行VvMADS46基因的亚细胞定位分析及过量表达番茄性状观察,研究其功能。【结果】VvMADS46在无核白和红地球的根、茎、叶、花序、花、卷须、果实等不同组织中均有表达,在花中的表达量较高,在果实中的表达量次之,而在茎、叶和卷须中的表达量较低;花后33、36、39、42 d 4个时期无核葡萄无核白、火焰无核VvMADS46的表达量都显著高于有核葡萄红地球、巨峰;构建了VvMADS46基因的亚细胞定位载体,通过农杆菌侵染洋葱,发现了VvMADS46定位在细胞核上;克隆了VvMADS46基因,在NCBI数据库进行序列比对,得到其同源基因为AP3基因,筛选得到AtAP3、AeAP3、CmAP3、LjAP3、LrAP3、PhAP3、AcAP3和PtAP3,并构建了系统发育树;构建了VvMADS46基因的植物过量表达载体,采用农杆菌介导法转化模式植物番茄,发现转基因番茄植株明显矮小且种子显著变小。【结论】VvMADS46与葡萄胚珠败育、无核性状发生存在密切联系。

无核玫瑰香味葡萄种质创新及胚挽救技术优化

萜类物质是调控葡萄果实香味的主要物质。研究以‘玫瑰香’等8个鲜食葡萄成熟果实为试材,检测萜类物质合成途径关键酶基因在不同葡萄中的表达情况,并以此类基因高表达的玫瑰香味葡萄作父本,通过离体胚挽救创新无核香味葡萄种质资源。针对采样时间与培养基成分,对胚挽救技术进行优化。利用分子标记技术对双亲鉴定,对F1代无核性状进行早期辅助选择。结果表明:萜类物质合成关键酶基因在‘玫瑰香’和‘183’中表达高于其他品种;‘京早晶’及‘Fresno Seedless’做母本时最佳采样时间分别为授粉后42 d和36 d;幼胚离体培养以WPM+0.1 mg/L BR+0.2 mg/L 6-BA作胚萌发培养基,胚萌发率较高。通过无核分子标记鉴定出56个株系具有特异性条带,其中14个株系均能在两种不同无核标记下扩增出特异性条带。

蓝莓VcILR1基因的克隆与表达分析

[目的]克隆蓝莓(Vaccinium spp)生长素酰胺水解酶基因VcILR1,分析该基因在蓝莓花、叶、茎、果和根中的表达模式和经过赤霉素处理的青果和成熟果两个时期的表达情况,为进一步探究该基因功能和蓝莓胚珠败育的机制提供依据。[方法]以蓝莓果实的cDNA为模板克隆得到VcILR1基因,利用ProtParam等工具对VcILR1进行生物信息学分析,利用qRT-PCR方法对VcILR1基因在蓝莓不同组织及赤霉素处理的青果和成熟果中的表达量进行分析。[结果]成功克隆到蓝莓VcILR1基因,该基因含976 bp的开放阅读框(ORF),编码325个氨基酸,有两个保守结构域,分别是Peptidase_M20和M20_dimer;编码蛋白的分子质量35 364.20 kDa,理论等电点5.67,不稳定系数43.57,脂肪系数88.55,亲水性平均值-0.054,属于不稳定亲水性蛋白。系统进化树分析表明蓝莓VcILR1基因与山茶科植物的茶树(Camellia sinensis)生长素酰胺水解酶(IAA-Leucine Resistant 1-like,ILL)基因亲缘关系较近。qRTPCR分析结果显示,VcILR1在蓝莓花、叶、茎、果和根中均有表达,在叶片中表达量最高,具有组织特异性;赤霉素处理能上调果实中VcILR1的表达。[结论]赤霉素处理后蓝莓青果和成熟果中VcILR1的表达量均显著增高,推测赤霉素处理能够促进蓝莓果实中生长素含量的提高,从而抑制胚珠发育,导致果实无籽。

植物无籽果实发生机理研究综述

无籽果实以其含糖量高、口感好、食用方便等优点一直深受人们的喜爱。但无籽果实发生的机理并不都是一样的,本文从两大方面阐述了无籽果实产生的原因,对植物无籽果实新品种的研究培育提供理论依据。

无核白葡萄多酚氧化酶基因的克隆与序列分析

为获得无核白葡萄中多酚氧化酶(PPO)的基因序列,以无核白葡萄果实为试材,进行基因同源克隆,得到多酚氧化酶基因CDS全长序列,其完整的编码框为1 824 bp,编码607个氨基酸(GenBank登陆号为KP271928);系统进化分析可知,其与葡萄科植物PPO基因同源性最高;生物信息学方法发现该蛋白分子量为67 392.44 Da,等电点为6.42,具典型的酪氨酸家族结构域,无信号肽结构,但有一个跨膜结构域,为亲水性蛋白;二级结构预测发现,PPO具有CuA与CuB两个结合区,分别嵌入蛋白活性腔中。该研究为进一步从分子水平探讨多酚氧化酶与褐变的关系奠定理论基础。

无籽刺梨(Rosa kweichonensis var.sterilis)RksAGL基因克隆及表达分析

以无籽刺梨(Rosa kweichonensis var.sterilis)花芽提取的RNA为模板,采用同源克隆结合RACE技术克隆得到无籽刺梨AGL基因的c DNA全长,命名为Rks AGL。序列分析表明,c DNA全长1 089 bp,开放阅读框长度为747 bp,可编码248个氨基酸。编码蛋白分子质量预测为28.56 k D,等电点为9.40,无信号肽序列。分析表明,Rks AGL基因属于MADS-box基因家族C类基因,其编码的蛋白与其它植物AGAMOUS类蛋白具有较高的同源性。实时定量PCR分析表明,RksAGL基因仅在雄蕊和心皮中表达。

农杆菌介导的无籽基因转化诺丽根段

[目的]为获得无籽诺丽植株。[方法]实验利用含有无籽基因的农杆菌对诺丽根段进行遗传转化,诺丽根段经预培养3 d、农杆菌液侵染20 min、共培养基暗培养3 d、筛选培养20 d后得到抗性芽,继代筛选后得到转化子;通过提取诺丽转化子叶片的DNA,以NptⅡ为引物进行PCR检测;将阳性植株进行生根培养后,炼苗并移栽至营养钵,观察其生长状况。[结果]表明:诺丽根段经过筛选培养后,获得225株抗性芽,抗性芽平均分化率为56. 25%;抗性芽继代筛选培养后得到94株转化子,对其进行PCR检测,获得18株转基因阳性植株;移栽后,能正常生根且于营养钵中正常生长。[结论]经PCR初步鉴定,无籽基因成功导入诺丽植株中,转化率为8%。