沙冬青种子总黄酮对小鼠急性毒性作用研究

研究沙冬青种子总黄酮对小鼠的急性毒性作用,并测定沙冬青种子总黄酮单次给药的半数致死剂量(LD50)或最大耐受剂量(MTD).将70只体质量为(20±2)g的SPF级KM小鼠随机分成7组,雌雄各半,每组每只小鼠分别灌胃0.4mL的无菌生理盐水(对照组)及相同体积、不同浓度沙冬青种子总黄酮溶液,灌胃后7d内仔细观察小鼠的反应,观察并记录小鼠中毒症状和死亡数,利用改良寇氏法测定该总黄酮的LD50.试验结束后记录各组小鼠的体质量变化,进行病理剖检,同时每组随机取2只小鼠(雌雄各1只),分别采取心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏等进行病理组织学检查.结果表明:沙冬青种子总黄酮对小鼠的半数致死量LD50为2 004.47mg/kg,LD50的95%可信限为1 693.78～2 372.47mg/kg.死亡小鼠急性毒性主要表现为安静少动,即而出现走路不稳、腹卧昏睡、呼吸急促、连续性抽搐而死亡.说明小鼠在沙冬青种子总黄酮中毒后,心脏、肝脏、脾脏和肾脏等主要器官都受到一定程度的损害,但对小鼠的持续影响较小;沙冬青种子总黄酮毒性较低,符合低毒化合物标准(500～5 000mg/kg为低毒化合物).

沙冬青种子总黄酮测定方法及纯化工艺研究

旨在建立沙冬青种子总黄酮测定方法及沙冬青种子总黄酮纯化工艺。选用常用4种黄酮显色方法,通过紫外波长扫描分别确定槲皮素为对照品及沙冬青种子总黄酮的最佳吸收波长,建立标准曲线,并对各测定方法进行方法学验证,利用新建立的条件方法对沙冬青种子总黄酮进行含量测定;实验选择AB-8、D101、S-8型大孔树脂通过静态吸附及解析试验,筛选出AB-8型大孔树脂进行动态试验,建立大孔树脂纯化工艺条件,进一步通过乙酸乙酯进行萃取,提高其总黄酮纯度。结果显示,以槲皮素为对照品,采用Al Cl3-CH4O显色法,在检测波长为335 nm条件下可对沙冬青种子总黄酮含量进行有效测定;AB-8型大孔树脂在上样液浓度为6 mg/m L、上样液p H5.5、上样液体积5 BV、上样液流速3.5 BV/h条件下吸附,以70%乙醇、洗脱液流速1.5 BV/h、洗脱液体积6 BV条件下洗脱,沙冬青种子总黄酮含量由纯化前5.69%提高到41.07%;用AB-8树脂纯化后的总黄酮配置成一定浓度溶液后用乙酸乙酯萃取,总黄酮含量达到76.15%。

沙冬青种子总黄酮对免疫抑制小鼠免疫功能及胸腺和脾超微结构的影响

旨在深入探讨沙冬青种子总黄酮对免疫抑制小鼠的免疫功能及胸腺和脾超微结构的影响。将100只昆明种小鼠随机分为5组:空白对照组、免疫抑制组、试验Ⅰ组、试验Ⅱ组和试验Ⅲ组,每组20只(雌雄各半),采用灌胃法给药,前7d,免疫抑制组、试验Ⅰ组、试验Ⅱ组与试验Ⅲ组小鼠均灌胃0.6mL环磷酰胺溶液;后21d,试验Ⅰ组、试验Ⅱ组、试验Ⅲ组分别灌胃0.6mL黄酮剂量为50、150、250mg·(kg·d)^(-1)的总黄酮溶液,未明确写出的组别和时间点在上述给药时段相应灌胃0.6 mL生理盐水。试验28d后,分别测定碳粒廓清指数和脏器指数(胸腺、脾)及小鼠血清IL-2、IL-4含量。同时,采用扫描电镜观察脾和胸腺结构。结果表明,灌胃环磷酰胺可复制小鼠免疫抑制模型。不同剂量的沙冬青种子总黄酮能不同程度提高免疫抑制小鼠胸腺和脾指数、碳粒廓清指数、吞噬指数以及血清IL-2和IL-4含量,尤其试验Ⅱ组,总黄酮灌胃剂量为150mg·(kg·d)^(-1),其效果最为突出,与免疫抑制组比较均差异极显著(P<0.01)。电镜观察显示,沙冬青种子总黄酮不同剂量试验组小鼠胸腺、脾中成熟淋巴细胞数量与免疫抑制组小鼠比较均不同程度增多,尤其试验Ⅱ组中成熟淋巴细胞数量增多最明显(P<0.01),且淋巴细胞排列紧密,与周围间质间隙明显减少。上述结果提示,沙冬青种子总黄酮可通过促进免疫器官淋巴细胞的增殖和成熟,改善和修复受损免疫器官组织结构,从而达到改善和增强免疫抑制小鼠免疫功能的作用,且在一定范围内具有剂量依赖效应。

沙冬青种子总黄酮活性成分分析及对小鼠免疫功能的影响

本研究旨在通过高效液相色谱-质谱联用(LC-MS)和高效液相色谱(HPLC)技术对沙冬青种子总黄酮主要活性成分进行分析及含量测定,并探索沙冬青种子总黄酮对小鼠免疫功能的影响。采用LC-MS分析沙冬青种子总黄酮主要活性成分,在HPLC优化条件下用标准品对主要活性成分的含量进行测定;采用MTT法和ELISA试剂盒检测沙冬青种子总黄酮对小鼠脾淋巴细胞增殖和IL-2、IL-4生成的影响,以及总黄酮对肝脏KCs细胞的增殖和NO、NOS含量的影响;运用定量溶血分光光度法和血清溶血素HC 50测定法检测不同浓度沙冬青种子总黄酮对小鼠抗体生成细胞和血清溶血素的影响。结果显示,沙冬青种子总黄酮中主要活性成分为芒柄花素、7,3’-二羟基-4’-甲氧基黄酮、黄豆黄素和穗花杉双黄酮,其中,芒柄花素含量高达52.48%,其次为7,3’-二羟基-4’-甲氧基黄酮,含量为11.20%。在2.5~100μg/mL总黄酮作用下,沙冬青种子总黄酮对脾淋巴细胞的增殖和细胞因子的产生具有明显的促进作用,尤其在20μg/mL时脾淋巴细胞增殖率和IL-2的分泌量分别高达217.62%和159.661 pg/mL,与空白对照组相比差异极显著(P<0.01);在40μg/mL时,脾淋巴细胞IL-4的分泌量高达149.274 pg/mL,极显著高于空白对照组(P<0.01)。沙冬青种子总黄酮对KCs细胞的增殖及NO和NOS分泌也具有明显促进作用,在60μg/mL时,与空白对照组相比,KCs细胞增殖率达67.77%,NO和NOS的分泌量分别达180.106和29.942μmol/L(P<0.01)。此外,沙冬青种子总黄酮能明显促进小鼠体内抗体生成细胞和血清溶血素含量的增加。综上表明,沙冬青种子总黄酮主要活性成分为芒柄花素和7,3’-二羟基-4’-甲氧基黄酮。沙冬青种子总黄酮对小鼠免疫活性细胞的增殖、相关免疫细胞因子和抗体的产生与释放等都具有显著的促进作用。

沙冬青种子总黄酮提取纯化与急性毒性及抗氧化活性研究

本研究旨在探讨沙冬青种子总黄酮的提取纯化、急性毒性和抗氧化活性等特性。采用超声辅助提取法提取纯化沙冬青种子总黄酮,用AlCl_3-CH_4O显色法进行沙冬青种子总黄酮含量测定;对纯化后沙冬青种子总黄酮进行急性毒性试验;采用体外Fenton体系产生羟基自由基(·OH)和邻苯三酚自氧化法产生超氧自由基(O^-_2),检测沙冬青种子总黄酮对·OH和O^-_2的清除作用;测定沙冬青种子总黄酮对衰老小鼠血清丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响。结果显示,沙冬青种子总黄酮含量测定方法的精密度(RSD=0.78%)、重复性(RSD=0.52%)、稳定性(RSD=0.65%)、回收率(99.140%)均在误差范围内,提取纯化后沙冬青种子总黄酮含量达86.780%。沙冬青种子总黄酮属于无毒化合物,并对·OH和O^-_2具有良好的清除能力,在总黄酮作用剂量为1 250μg/mL时,对·OH和O^-_2的清除率分别达96.45%和50.39%。与衰老模型组小鼠相比,沙冬青种子总黄酮可极显著提高小鼠血清SOD活力(P<0.01),其中,在150 mg/(kg·d)总黄酮剂量组,小鼠血清SOD活力高达102.42 U/mL。此外,与衰老模型组小鼠相比,沙冬青种子总黄酮可极显著降低小鼠血清中MDA含量(P<0.01),以150 mg/(kg·d)总黄酮剂量组降低效果最明显。上述结果提示,沙冬青种子总黄酮具有良好的自由基清除能力和抗氧化活性,从而有效改善和提高机体免疫力。

沙冬青种子总黄酮对小鼠免疫器官淋巴细胞活性的影响

【目的】探索沙冬青种子总黄酮对小鼠免疫器官淋巴细胞活性的影响.【方法】将50只试验小鼠随机分为空白组、免疫抑制组、黄酮Ⅰ组、黄酮Ⅱ组及黄酮Ⅲ组,每组10只,灌胃给药.试验28 d后,分别测定脏器指数(胸腺、脾脏)并采集样品进一步采用石蜡包埋切片和染色技术、免疫组织化学分析技术等,探讨胸腺、脾脏中淋巴细胞活性的变化.【结果】小鼠免疫抑制模型复制成功,CTX显著诱导小鼠免疫器官淋巴细胞凋亡.同时,不同剂量沙冬青种子总黄酮灌胃试验组,能不同程度促使免疫抑制小鼠脾脏和胸腺淋巴细胞增殖,进而促使胸腺皮质和脾脏白髓面积增大,尤其总黄酮灌胃剂量150 mg/(kg•d)组小鼠表现最明显,胸腺皮质和脾脏白髓面积分别达到(83.11±1.25)μm^(2)、(47.00±1.55)μm^(2),显著高于免疫抑制组(P<0.01).免疫组化分析显示,不同剂量沙冬青种子总黄酮灌胃试验组,能不同程度促使免疫抑制小鼠脾脏和胸腺CD3阳性T淋巴细胞及CD20阳性B细胞增殖,尤其在总黄酮灌胃剂量150 mg/(kg•d)组增殖效果最突出,均显著高于免疫抑制组(P<0.01).【结论】沙冬青种子总黄酮可显著促进免疫抑制小鼠T、B淋巴细胞增殖,修复受损免疫器官,从而改善和增强机体免疫功能.

沙冬青种子总黄酮抗病毒活性的研究

为了探讨沙冬青种子总黄酮抗牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的作用机制,以细胞存活率和抑制率为指标,采用MTT比色法进行了沙冬青种子总黄酮抗BVDV活性的研究。分别采用感染病毒同时给药、给药后接种病毒、先感染病毒后给药三种方式,观察沙冬青种子总黄酮的抗BVDV活性。结果显示,抗BVDV作用具有很好的量效关系,沙冬青种子总黄酮在体外随药物质量浓度的增加,细胞存活率和病毒抑制率明显升高,病毒的TCID50为10-5.29/0.1mL;药物质量浓度在小于0.188mg/mL范围内同时给药途径的细胞保护率和病毒抑制率明显高于其余2种给药途径。结果表明,沙冬青种子总黄酮在体外有良好的抗BVDV活性的作用。

沙冬青种子总黄酮对免疫抑制小鼠的免疫功能及体外脾淋巴细胞增殖的影响

本研究旨在深入探讨沙冬青种子总黄酮对免疫抑制小鼠的免疫功能及体外脾淋巴细胞增殖的影响。试验分体内与体外两部分。体内试验：将100只昆明种小鼠随机分为5组,每组20只（雌雄各半）小鼠,分别为空白对照组（生理盐水组）、免疫抑制模型组、总黄酮灌胃试验Ⅰ组[50 mg/（kg·d）]、试验Ⅱ组[150mg/（kg·d）]和试验Ⅲ组[250 mg/（kg·d）]。上述小鼠试验28 d后,分别测定碳粒廓清指数和脏器指数（胸腺、脾）及小鼠血清IL-2、IL-4含量。体外试验：制备小鼠脾淋巴细胞悬液后,试验分为4组：沙冬青种子总黄酮作用组（试验组Ⅰ）、沙冬青种子总黄酮＋Con A混合组（试验组Ⅱ）、Con A阳性对照组（试验组Ⅲ）、细胞悬液阴性对照组（试验组Ⅳ）。采用体外细胞培养技术、噻唑蓝（MTT）还原法检测体外培养脾淋巴细胞增殖的变化。结果表明,灌胃环磷酰胺可复制小鼠免疫抑制模型。不同剂量的沙冬青种子总黄酮能不同程度地提高免疫抑制小鼠胸腺和脾指数、碳粒廓清指数和吞噬指数以及血清IL-2和IL-4含量,尤其总黄酮灌胃剂量为150mg/（kg·d）的试验Ⅱ组,可显著提高免疫抑制小鼠的胸腺和脾指数、碳粒廓清指数和吞噬指数以及血清IL-2和IL-4含量,与免疫抑制模型组比,差异极显著（P〈0.01）。同时,沙冬青种子总黄酮可显著诱导小鼠脾淋巴细胞体外增殖,且这种诱导增殖效应与沙冬青种子总黄酮作用剂量呈正相关性。此外,Con A可协同沙冬青种子总黄酮诱导体外培养脾淋巴细胞的增殖。上述结果提示,沙冬青种子总黄酮可通过促进免疫器官淋巴细胞的增殖和成熟,改善和增强免疫抑制小鼠的免疫功能。