人肝中硒蛋白K相互作用蛋白的筛选与验证

以硒蛋白K(SelK)突变体为"诱饵",采用酵母双杂交系统对人肝cDNA文库进行筛选,得到一个与SelK相互作用的蛋白──环腺苷酸应答元件结合蛋白3(CREB3).将SelK与CREB3共同转染酵母细胞,验证了SelK与CREB3的相互作用;并采用受体漂白、敏化发射和荧光寿命3种荧光共振能量转移方法进一步验证了二者间的相互作用,发现其不受SelK中硒代半胱氨酸(Sec)的影响.推测SelK可能通过其Sec之前的区域与CREB3发生作用,参与CREB3介导的内质网相关降解过程,影响相关癌症的转移和发展.

硒蛋白K在小鼠中的组织差异表达及T淋巴细胞内定位

目的检测硒蛋白K(Sel K)在小鼠脾、肾、肠、肺、脑、肝组织中的表达差异及在T淋巴细胞内的定位,为研究Sel K的分布与生物学功能的关联性提供参考。方法采用实时荧光定量PCR,Western blot以及免疫组化方法检测硒蛋白K在小鼠各组织的表达差异,并采用细胞免疫化学的方法 ,用激光共聚焦显微镜观察硒蛋白K在小鼠T淋巴细胞内的定位。结果实时荧光定量PCR结果显示硒蛋白K在小鼠各组织中均有表达,并且在脾脏中的表达明显高于其他组织(P<0.05)。Western blot及免疫组化结果与实时荧光定量PCR结果基本一致。细胞免疫化学结果显示硒蛋K在小鼠T淋巴细胞中定位于内质网。结论硒蛋白K是一种在脾脏中高表达的内质网蛋白。

干扰硒蛋白K对小鼠T淋巴细胞钙流和白介素2受体表达的影响

目的探讨硒蛋白K(Selenoprotein K,Sel K)基因沉默(RNA silence,RNAi)对小鼠T淋巴细胞内钙流和白介素2受体(Interleukin-2 Receptor,IL-2R)分泌的影响。方法制作小鼠T淋巴细胞干扰载体p GPU-Sel K,用脂质体Lipofectin 2000将干扰质粒和对照质粒转染小鼠T淋巴细胞,Real time PCR和Western Blot分别检测核酸和蛋白水平Sel K的表达,流式细胞仪检测细胞内钙离子浓度,Real time PCR检测IL-2R的分泌。结果与转染的对照组质粒p GPU-NC比较,转染p GPU-Sel K载体的细胞Sel K在m RNA和蛋白水平表达分别显著降低了42.37%(P<0.01)和45.44%(P<0.01)。另外干扰组整体细胞内钙离子浓度显著低于对照组(P<0.05),细胞分泌IL-2R水平也显著降低(P<0.05)。结论干扰载体p GPU–Sel K可以下调小鼠T淋巴细胞Sel K的表达,抑制细胞的钙流和IL-2R的分泌,从而可能改变小鼠T淋巴细胞增殖分化。

硒蛋白K基因干扰对T淋巴细胞内质网钙稳定蛋白的影响

目的探讨SelK mRNA干扰效果及其硒蛋白K(SelK)基因干扰后对细胞内质网钙稳态蛋白(endoplasmicreticulum calcium homeostasis protein,CHERP)的表达,观察T淋巴细胞内Ca^(2+)浓度的变化。方法从SelK m RNA(NM_019979.2)的编码序列中符合设计要求的靶位点设计特异性干扰SelK mRNA的RNAi片段,构建shRNA干扰载体靶向干扰SelK RNA,用核酸序列分析方法分析重组片段的正确性,利用荧光定量PCR和Westeron blot鉴定SelK mRNA的干扰效果,采用Real time-PCR的方法检测SelK干扰后细胞内的CHERP的变化。结果阳性重组载体可以被BamH I酶切。酶切片段序列分析重组子质粒结果与所设计片段完全一致,正确率为100.0%。三个ShRNA表现了不同的干扰效果,sh222、sh102和sh101的干扰效率分别为12.13%、16.46%和42.37%,在核酸水平上重组质粒sh101对SelK的干扰效果最佳,与sh222和sh102相比,差异有统计学意义(P<0.01)。Western blot检测重组质粒sh101在蛋白水平上的干扰效率为45.4%,干扰组细胞中CHERP的表达与对照组相比抑制率达到40.0%。结论重组质粒sh101对SelK在核酸和蛋白质水平上都有较好的干扰效率,SelK干扰对细胞中CHERP的表达有抑制的作用,或因此打乱了内质网与胞质中的钙离子平衡,从而影响到了细胞内游离的钙离子浓度,是导致T淋巴细胞激活的因素之一。

大豆硒蛋白对糖尿病大鼠心肌损伤的保护作用

目的探讨大豆硒蛋白对糖尿病大鼠心肌损伤的保护作用。方法 Wistar大鼠50只,,随机分为正常对照组(NC)、糖尿病对照组(DM)、低剂量Se治疗组(L-Se)、中剂量Se治疗组(M-Se)、高剂量Se治疗组(H-Se)。后4组腹腔注射链脲佐菌素55 mg/kg制备DM模型。第7w起,NC、DM组予0.5%CMC-Na 10ml/(kg.d),L-Se、M-Se、H-Se组分别予大豆硒蛋白2,4,8g/(kg.d)灌胃。第12w末处死大鼠,检测血糖、血清及心肌组织中SOD、GSH-Px、NOS活性和MDA、NO含量以及心肌组织中Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPase活性。结果与模型组比较,补充外源性大豆硒蛋白后,M-Se、H-Se组可明显降低糖尿病大鼠血糖及MDA含量(均P<0.001),显著增加血清GSH-Px、NOS活性(P<0.001),同时使心肌线粒GSH-Px活性、NO含量明显增加(均P<0.001),并且使心肌组织Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPase活性显著增加(P<0.01,P<0.001)。结论大豆硒蛋白对糖尿病大鼠心肌损伤具有保护作用。

内质网硒蛋白的研究进展

硒是哺乳动物必需的一种微量营养元素,主要以硒代半胱氨酸的形式存在于各种硒蛋白中,硒的主要生物功能通过硒蛋白实现.在25种哺乳动物硒蛋白中,有7种硒蛋白位于内质网,分别为2型脱碘酶、15-kDa硒蛋白、硒蛋白M、硒蛋白T、硒蛋白K、硒蛋白S和硒蛋白N.除了2型脱碘酶外,对其余内质网硒蛋白知之甚少.最近一些研究显示,一些内质网硒蛋白在氧化还原平衡调节、蛋白质折叠质量控制、错误折叠蛋白从内质网逆向转运至胞质、Ca2+稳态调节、内质网应激调节及炎症调节等过程中发挥作用.本文介绍了每种内质网硒蛋白的结构、功能及其生理和病理作用的一些最新研究进展,并对未来需要研究的内容进行了展望.