半枝莲含药血清通过抑制mTOR信号通路影响非小细胞肺癌NCI-H1650细胞上皮间质转化

目的探讨半枝莲含药血清通过抑制雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路影响非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)NCI-H1650细胞上皮间质转化。方法选取健康青紫蓝大白兔制备半枝莲含药血清,根据不同剂量分为对照组、低剂量组(A组)、中剂量组(B组)、高剂量组(C组)。选取人非小细胞肺癌细胞NCI-H1650与含药血清培养,采用逆转录RT-PCR、免疫印迹、MTT、划痕实验等方法,观察4组不同剂量半枝莲含药血清抑制mTOR信号通路对NCI-H1650细胞上皮间质转化、增殖、迁移的影响。结果4组mTOR表达量差异具有统计学意义,其中C组mTOR表达量低于对照组和A组(P<0.05);4组Vimentin、N-cadherin、E-cadherin蛋白表达相对灰度值差异具有统计学意义,且C组Vimentin、N-cadherin灰度值低于对照组、A组、B组,E-cadherin灰度值高于对照组(P<0.05);4组24、48、72 h吸光度差异具有统计学意义,且C组24、48、72 h吸光度低于对照组、A组、B组(P<0.05);4组NCI-H1650细胞迁移率差异具有统计学意义,且A组、B组、C组迁移率低于对照组,C组低于A组、B组(P<0.05)。结论高剂量半枝莲含药血清可通过抑制mTOR信号通路影响NCI-H1650细胞上皮间质转化、增殖及迁移,从而抑制NSCLC发生和发展。

“引气归元健脾胃”针法治疗单纯性肥胖疗效及对血清炎症因子、mTOR水平的影响

目的:观察"引气归元健脾胃"针法治疗单纯性肥胖的效果及对患者血清炎症因子、mTOR的影响。方法:将80例单纯性肥胖患者随机分为针刺组和药物组,每组各40例,均予健康指导,药物组予盐酸二甲双胍0. 85 g/次,2次/天,餐前服;针刺组予"引气归元健脾胃"针法治疗,1次/天,5次为1个疗程,共12个疗程。分别于试验前、试验第4、8、10、12个疗程观察两组患者体重、腰臀比、血脂及血清IL-6、TNF-α、IL-1β、mTOR水平。疗程结束3个月后随访。结果:两组患者治疗前体重、腰臀比、血脂及血清IL-6、TNF-α、IL-1β、mTOR差异无统计学意义(P> 0. 05);第4疗程结束后,药物组体重显著下降(P <0. 05);第8疗程结束后,两组体重均下降(P <0. 05),药物组优于针刺组(P <0. 05),药物组血清mTOR水平显著下降(P <0. 05),针刺组mTOR水平无变化,针刺组IL-6、TNF-α、IL-1β水平显著下降;第10疗程和第12疗程结束后,两组体重、血脂及血清IL-6、TNF-α、IL-1β、mTOR均显著下降(P <0. 05),且组间无差异(P> 0. 05),与治疗前比较针刺组腰臀比显著减小(P <0. 05)。疗程结束3个月后随访,与末次治疗比较,针刺组关键指标均未升高(P> 0. 05),而药物组体重、血脂和血清IL-6、TNF-α、IL-1β、mTOR明显升高(P <0. 05)。结论:临床运用"引气归元健脾胃"针法治疗单纯性肥胖患者,在治疗10个疗程后,减肥效果与二甲双胍相当;"引气归元健脾胃"针法能下调血清IL-6、TNF-α、IL-1β、mTOR水平,mTOR信号通路参与针灸减肥的作用机制有待进一步研究揭示。

螺旋藻多糖对子宫内膜异位大鼠血清指标及PI3K/Akt/mTOR信号通路基因表达的影响

近年来,子宫内膜异位症(endometriosis,EMs)发病率明显增加,给女性身心健康带来极大危害。螺旋藻多糖(polysaccharides from Spirulina,PSP)是一类具有多重功效的天然生物大分子,具有抗炎、抗细胞增殖等多种功能,药理学上具有治疗EMs的潜力。为了探讨PSP对EMs大鼠血清指标的影响及分子机制,本实验首先通过水提法提取PSP,柱层析法测得纯度为89%;以SD大鼠为模式动物,采用自体移植术成功制备了大鼠EMs模型,通过饲喂不同剂量的PSP,观察对EMs的治疗效果;用Western blot和RT-PCR检测PI3K/Akt/mTOR通路蛋白及mRNA含量。结果表明:与对照组相比,模型组EMs可显著增加大鼠血清中TNF-α、VEGF、MMP-2的水平;与模型组相比,不同剂量的PSP均可缓解EMs症状,具体表现为EMs病灶减小,血清TNF-α、VEGF、MMP-2等含量的降低。模型组中,PI3K、AKT、mTOR在转录水平与蛋白水平表达量均显著升高,而PSP治疗组PI3K、AKT、mTOR在转录水平与蛋白水平表达量显著降低。研究结果提示PSP可能通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路进而改善EMs症状。

“秩边透水道”针法对子宫内膜异位症大鼠PI3K/AKT/mTOR信号通路及血清指标的影响

目的:观察“秩边透水道”针法对子宫内膜异位症(EMs)大鼠PI3K/AKT/mTOR信号通路、血清EMAb、CA125及VEGF的影响,探讨“秩边透水道”针法治疗子宫内膜异位症的作用机制。方法:45只雌性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、针刺组、激动剂组与针刺加抑制剂组,各9只。假手术组不造模,余组采用自体移植术造模成功后,假手术组和模型组不干预,治疗各组分别予以秩边透水道针法、自噬激动剂雷帕霉素、秩边透水道针法加自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤进行干预。HE染色分析内膜组织形态,电镜观察自噬小体。Western blot法检测PI3K/AKT/mTOR通路蛋白含量,ELISA法测定各组血清EMAb、CA125及VEGF的含量。结果:与假手术组比较,模型组血清中EMAb、CA125、VEGF含量以及内膜组织中PI3K、AKT和mTOR的蛋白水平表达量显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,针刺组、激动剂组和针刺加抑制剂组血清中EMAb、CA125、VEGF含量以及内膜组织中PI3K、AKT和mTOR蛋白水平表达量显著降低,差异具有统计学意义(P<0.01);与针刺加抑制剂组比较,针刺组与激动剂组血清中EMAb、VEGF含量、CA125含量以及PI3K、AKT和mTOR蛋白水平显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01);针刺组和激动剂组血清中EMAb、CA125、VEGF含量以及内膜组织中PI3K、AKT和mTOR蛋白水平表达量相比无统计学意义。结论:针刺可能通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路进而诱导自噬改善EMs症状。

尿毒症患者血清PTH对大鼠肾小球系膜细胞体外增殖及PI3KAktmTOR信号通路的影响

目的探讨尿毒症患者血清甲状旁腺激素(PTH)对大鼠肾小球系膜细胞(GMC)体外增殖及磷脂酰肌醇-3/蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信号通路的影响。方法选取2015年1月~2018年9月成都市第三人民医院肾内科收治的72例尿毒症患者,根据血清PTH水平分为正常组16例、轻中度增高组33例、重度增高组23例,常规体外培养大鼠GMC细胞,比较3组12、24、48 h GMC细胞光密度值、GMC细胞周期时相分布、mTOR、Caspase-3表达情况。结果重度增高组12、24、48 h GMC细胞光密度值均高于正常组、轻中度增高组,且轻中度增高组12、24、48 h GMC细胞光密度值均高于正常组(P<0.05);3组GMC细胞光密度值在12、24、48 h随时间推移逐渐递增(P<0.05);与正常组相比,轻中度增高组、重度增高组GMC细胞进入S、G2/M期明显增多(P<0.05);重度增高组GMC细胞进入S、G2/M期细胞多于轻中度增高组(P<0.05);轻中度增高组、重度增高组mTOR表达量高于正常组,Caspase-3表达量低于正常组(P<0.05);重度增高组mTOR表达量高于轻中度增高组,Caspase-3表达量低于轻中度增高组(P<0.05)。结论尿毒症患者血清可导致GMC增殖,且甲状旁腺功能亢进可促进GMC增殖,提高PI3K/Akt/mTOR信号通路表达,PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制剂可能有助于抑制GMC增殖,延缓尿毒症患者肾功能衰竭进程。

短期血清饥饿胁迫对猪骨骼肌卫星细胞代谢及自噬发生的影响

旨在研究短期饥饿胁迫对猪骨骼肌卫星细胞(skeletal muscle satellite cells,SMSCs)代谢及自噬发生的影响,解析自噬机制在骨骼肌发育调控网络中的地位和作用,为改良家猪产肉性状提供理论依据。将本实验室分离并保存的SMSCs细胞系复苏,按培养体系中血清浓度将细胞分为20%血清组(对照组)、15%血清组、10%血清组、5%血清组和0%血清组,以形成不同程度的饥饿胁迫。当细胞融合度达到70%~80%后再培养24 h进行检测,每组4个重复。流式细胞术检测各组细胞凋亡率、膜电位和活性氧水平;试剂盒测定ATP水平;WB检测自噬标志蛋白LC3B-Ⅱ、p62和通路相关蛋白AMPK、mTOR的表达;透射电镜检测细胞线粒体形态和细胞器的变化。结果显示,随着细胞中血清浓度降低,细胞活力、p62蛋白量、p-mTOR/mTOR比值逐渐降低;细胞凋亡率、ROS水平、ATP水平、LC3B-Ⅱ蛋白水平、p-AMPK/AMPK比值、细胞内自噬溶酶体数量、细胞核及线粒体异常率则逐渐升高;与对照组相比,15%组膜电位显著升高,5%和0%组极显著降低。这表明,短期血清饥饿胁迫能诱导基于AMPK/mTOR信号通路的自噬发生,加快细胞代谢,但同时存在加快细胞凋亡、抑制细胞增殖等毒副作用。

长时间血清饥饿胁迫对猪骨骼肌卫星细胞代谢和自噬的影响

为了探究长时间、不同程度饥饿胁迫条件对原代猪骨骼肌卫星细胞(SMSCs)代谢和自噬的影响,本试验通过控制SMSCs培养体系中血清浓度以形成不同程度饥饿胁迫,其中20%血清培养浓度为正常对照组,15%、10%、5%和0%血清培养浓度为试验组。细胞培养96 h后,通过流式细胞术检测各组细胞凋亡率、线粒体膜电位和活性氧(ROS)水平,通过ATP检测试剂盒测定细胞内ATP水平,通过Western blot检测各组细胞蛋白中自噬标志蛋白LC3b、p62以及AMPK-mTOR自噬信号通路中p-AMPK/AMPK和p-mTOR/mTOR蛋白的表达。结果显示,与20%血清组相比,0%血清和5%血清细胞凋亡率极显著上调(P<0.01),10%血清组细胞凋亡率显著上调(P<0.05);各试验组线粒体膜电位均极显著下降(P<0.01),ROS水平和ATP水平均极显著上调(P<0.01);细胞中LC3b蛋白的相对表达量随血清浓度降低而升高,p62蛋白的相对表达量随血清浓度降低而降低;p-mTOR/mTOR比值随血清浓度降低而降低,p-AMPK/AMPK比值随血清浓度降低而升高。结果表明,通过长期减少SMSCs培养体系中血清浓度,可以促进细胞代谢加快和凋亡发生,并且通过AMPK/mTOR信号通路激发细胞发生自噬,上述变化的程度与血清减少的程度呈正相关。本试验为后续探索不同程度饥饿胁迫对动物肌肉发育影响的研究提供理论依据。

“引气归元健脾胃”针法对单纯性肥胖患者血清m TOR的影响

目的:观察"引气归元健脾胃"针法对单纯性肥胖患者血清哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)的影响。方法:选择2015年9月至2017年10月广西中医药大学第二附属医院瑞康医院及广西中医药大学仁爱分院针灸科、美容科门诊治疗的单纯性肥胖患者80例,符合单纯性肥胖的诊断标准,随机分为针刺组和药物组,每组40例。两组患者均给予健康指导,药物组给予盐酸二甲双胍口服治疗,针刺组给予"引气归元健脾胃"针法治疗。结果:治疗4个疗程后,药物组体质量、血清m TOR水平与治疗前比较下降显著(P <0. 05);治疗8个疗程后,两组体质量与治疗前比较均显著下降(P <0. 05),且药物组体质量优于针刺组(P <0. 05),药物组血清m TOR水平显著下降(P <0. 05),针刺组m TOR水平无显著变化;治疗10个疗程后、治疗12个疗程后,两组体质量、血脂及血清m TOR与治疗前比较均显著下降(P <0. 05),组间比较,差异无统计学意义(P> 0. 05),针刺组腰臀比与治疗前比较减小(P <0. 05)。疗程结束3个月后随访,与治疗12个疗程后比较,针刺组关键指标均无显著升高(P> 0. 05),而药物组体质量、血脂和血清m TOR均显著升高(P <0. 05)。结论:"引气归元健脾胃"针法治疗单纯性肥胖疗效显著,治疗10个疗程后,减肥效果与二甲双胍相当,降低腰臀比,不易反弹,"引气归元健脾胃"针法能显著下调血清m TOR水平。

PI 3K/Akt/mTOR信号通路介导艾灸改善大鼠卵巢早衰的研究

目的:探讨艾灸对雷公藤多苷片诱导的卵巢早衰大鼠卵巢的保护作用及机制。方法:雌性SD大鼠随机分为空白组、模型组、艾灸组,每组15只。除空白组外,模型组和艾灸组均采用雷公藤多苷片(40mg/kg)灌胃,每日1次,连续6周;灌胃第4周给予艾灸组悬灸"关元"及双侧"三阴交"10min,每日1次,治疗3周。HE染色观察卵巢组织形态结构;ELISA法检测血清中雌二醇(E2)、促黄体生成素(LH)、促卵泡生成素(FSH)等激素水平,白介素-6(IL-6)、IL-1β等炎性因子含量;Western blot法测定卵巢组织中磷脂酰肌醇3-激酶(PI 3K)、蛋白激酶B(Akt)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)含量及磷酸化水平。结果:与空白组相比,模型组卵巢内卵泡减少,卵泡的粒细胞层次明显减少,黄体减少,闭锁卵泡明显增多,血清中E2显著降低(P<0.01),LH、FSH、IL-6、IL-1β含量均显著增加(P<0.01),卵巢组织中p-PI 3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表达显著增加(P<0.01);与模型组相比,艾灸组卵巢组织病理损伤改善,艾灸能够显著降低血清中LH(P<0.05)、FSH(P<0.01)、IL-6(P<0.01)、IL-1β(P<0.01)含量,增加E2含量(P<0.05),降低卵巢组织磷酸化PI 3K、Akt、mTOR的表达水平(P<0.01)。结论:艾灸能够改善雷公藤多苷片诱导的大鼠卵巢早衰,其机制可能与抑制PI 3K/Akt/mTOR信号通路磷酸化相关。

不同营养状态下柯萨奇病毒B3感染HeLa细胞后对mTOR及p70S6KmRNA的影响

目的探讨不同营养状况下柯萨奇病毒B3（CVB3）感染HeLa细胞对mTOR信号通路的影响。方法采用非饥饿法和饥饿法2种方法培养HeLa细胞。（1）非饥饿法：HeLa细胞融合成40％～50％的单层细胞时，用含10g／L胎牛血清的细胞培养液换液培养24h后，病毒组用100倍半数感染量（100TCID50）的病毒干预，而对照组用病毒维持液（含胎牛血清2g／L细胞培养液）培养；（2）“饥饿法”：待HeLa细胞融合成40％～50％的单层细胞时，用不含胎牛血清的培养基换液培养24h后，病毒组用100TCID50的病毒干预，而对照组用病毒维持液（含胎牛血清2嚣／L的细胞培养液）培养。采用倒置显微镜观察细胞形态学变化，用实时荧光定量PCR检测3、6、9、12、24h不同时间点饥饿法及非饥饿法不同营养状态下HeLa细胞roTOR、p70S6KmRNA表达。结果非饥饿法：病毒组仅在12h及24hmTOR、p70S6KmRNA表达显著低于对照组（P均〈0．05）；饥饿法：病毒组各时间点均显著低于对照组（P均〈0．05）；饥饿法病毒组和对照组Hela细胞roTOR、p70S6KmRNA表达均高于非饥饿法，mTORmRNA差异均有统计学意义（P均〈0．05），而p70S6KmRNA差异均无统计学意义（P均〉0．05）。结论CVB3使HeLa细胞roTOR—PTOS6K信号通路表达下凋。

mTOR信号通路诱导的自噬在心肌细胞缺氧损伤中的作用研究

目的:探讨自噬在心肌细胞缺氧损伤中的作用及分子机制。方法:体外分离培养乳鼠心肌细胞,体外建立缺氧/去血清(H/SD)模型以模拟在体的缺血环境。分别给予自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3MA,5 mM)和mTOR抑制剂雷帕霉素(1.0μg/L)调节心肌细胞自噬水平。分别采用TUNEL染色检测心肌细胞凋亡,Western blot方法检测心肌细胞蛋白表达水平。结果:H/SD损伤可以显著诱导心肌细胞自噬水平(P<0.05),并且细胞自噬水平可以被3-MA及雷帕霉素调节。同时,H/SD可以显著增加心肌细胞凋亡(P<0.05),而给予3-MA抑制自噬水平可以减少细胞凋亡(P<0.05)。相反,雷帕霉素增加自噬同样可以加重缺氧导致的心肌细胞凋亡(P<0.05)。H/SD损伤过程中,心肌细胞mTOR信号通路被激活,而自噬抑制剂3-MA可以显著提高缺氧条件下心肌细胞中p-mTOR(Ser2448)的表达水平(P<0.05),并增加mTOR下游分子p-p70S6k(P<0.05)和p-S6(P<0.05)的表达。结论:mTOR信号通路诱导的细胞自噬可能参与了缺氧损伤诱导的心肌细胞凋亡。

血府逐瘀汤含药血清对低氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖及PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响

目的研究血府逐瘀汤含药血清对低氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖的影响及其机制。方法低氧诱导大鼠PASMCs增殖,设置正常对照组、低氧模型组、血府逐瘀低剂量组、血府逐瘀高剂量组和NVP-BEZ235组,血府逐瘀低、高剂量组含药血清浓度分别为5%和20%。运用CCK-8法检测不同低氧时间和药物干预对于PASMCs增殖的影响,Western Blot检测细胞p-Akt、p-mTOR和PCNA表达。结果低氧培养36 h时PASMCs OD值最高,且高于常氧培养(P<0.01);与正常对照组比较,低氧模型组OD值明显升高(P<0.01),p-AKT、p-mTOR、PCNA表达增加(P<0.05);与低氧模型组比较,血府逐瘀高剂量组和NVP-BEZ235组OD值不同程度降低(P<0.01),各药物组p-AKT、p-mTOR、PCNA表达减少(P<0.05);与血府逐瘀低剂量组比较,NVP-BEZ235组p-AKT、p-mTOR、PCNA表达减少(P<0.05)。结论血府逐瘀汤含药血清可以抑制低氧诱导的大鼠PASMCs增殖,可能通过阻断PI3K/Akt/mTOR信号通路活化并下调PCNA表达而发挥作用。