蛋白质酶促水解反应机理与动力学模型

研究蛋白质酶促水解制备生物活性多肽的反应机理与动力学行为,并建模表征不同反应机制的酶解曲线.基于对不同实验条件下反应时程特性的分析,以经典的米氏方程为理论基础,提出了同时考虑蛋白质单底物水解、蛋白酶失活以及底物或产物抑制因素的机理模型,并构建了指数形式动力学方程dh/dt=aexp(-bh),其中参数a和b对于不同反应机理具有不同的表达形式和确定的数值结果.对于牛血清白蛋白(BSA)-胰蛋白酶(trypsin)模型体系,经实验拟合平均相对误差为4.73%,并求得该体系相应热力学和动力学常数:Km=0.074 8 g/L,Ks=7.961 g/L,Kd=9.358min-1,k2=38.439 min-1,Ea=64.826 kJ/mol,Ed=80.031 kJ/mol.所建整套模型可用于蛋白质酶解反应过程的模拟、热动力学常数的计算和生物反应器的优化设计.

卵黄抗体添加剂对肉鸭生长性能及相关生理生化指标的影响

研究了卵黄抗体添加剂对肉鸭生长性能的影响,并对有关生化指标进行了分析。试验结果表明:①添加卵黄抗体使肉鸭平均日增重提高,料肉比降低,但小鸭阶段要比大鸭阶段效果好。②试验组各小肠段内容物的胰蛋白酶活性都有所提高,其中空肠的胰蛋白酶活性达到显著水平(P<0.05)。③试验组血清甲状腺素(T3)、胰岛素样生长因子(IGF-I)水平有显著的提高(P<0.05),T4水平有升高趋势但不显著。以上结果表明了卵黄抗体添加剂能提高小肠胰蛋白酶活性和影响有关代谢激素水平,从而促进肉鸭生长。

黑眶蟾蜍血清白蛋白的纯化及胰蛋白酶抑制活性

通过离子交换层析和凝胶过滤层析,从黑眶蟾蜍(Bufo melanostictus)血清中得到其白蛋白,命名为Bu-fom-SA。该蛋白有抑制胰蛋白酶水解小肽底物活性的作用,但对其他丝氨酸蛋白酶如凝血酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶及枯草杆菌蛋白酶无抑制。Bufom-SA对温度、pH及还原剂二硫苏糖醇的耐受性较强,3种因素对其胰蛋白酶抑制活性影响不大。黑眶蟾蜍血清白蛋白具有稳定的胰蛋白酶抑制活性,可能在黑眶蟾蜍防御天敌捕食的过程中发挥重要作用。

CDK4基因突变及其胰蛋白酶-抗胰蛋白酶失衡在胃癌发生中的作用

目的探讨胃癌患者中细胞周期蛋白依赖激酶基因(cell cycle-dependent protein kinase 4,CDK4)突变及其胃癌组织CDK4表达和血清胰蛋白酶-抗胰蛋白酶的失衡情况。方法应用PCR法扩增25例胃癌患者及62名健康体检者的CDK4基因外显子、启动子和侧翼序列,产物纯化后直接测序,分析不同基因型胃癌患者的临床特征,取患者的癌组织、癌旁组织和远离癌的正常组织做CDK4免疫组化,同时应用ELISA法检测同一时期患者及其对照的血清胰蛋白酶和α-抗胰蛋白酶水平,分析其差异性。结果在胃癌患者中发现CDK4基因3号外显子存在高频突变,其中5例患者为c.110 T>A突变,突变造成p.M37T;免疫组化显示,癌组织高表达CDK4,癌旁组织呈弱表达,远离癌的正常组织呈阴性;胃癌患者的血清胰蛋白酶浓度(33.98±11.24)ng/ml显著高于正常对照组(15.96±18.23)ng/ml,而血清抗胰蛋白酶浓度与正常对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 CDK4基因突变及其高表达与胃癌发生密切相关,机体内胰蛋白酶-抗胰蛋白酶的失衡可能是胃癌发病的重要原因。

胰酶化痰法检测五项肺肿瘤标志物探讨

探讨检测胰酶悬液消化痰液中的五项肺肿瘤标志物在肺癌诊断中的应用。使用胰酶悬液对肺癌、肺部良性病变患者痰标本消化,检测五项肿瘤标志物。结果表明:用pH8的6%胰酶消化痰液,并不影响五项肿瘤标志物测定;肺癌组患者血清和痰液CEA、CA125、CA15-3、CA211和NSE含量高于良性病变组,两组比较有显著性差异(P<0.05);痰液CEA、CA125含量明显高于血清,两组比较有显著性差异(P<0.05)。检测痰液CEA、CA125、CA15-3、CA211及NSE含量对诊断肺癌具有一定的临床应用价值,若结合其他诊断方法,将有助于对尚未确诊肺癌患者的进一步诊断。

胰蛋白酶水解牛血清白蛋白过程集总动力学研究

在间歇搅拌反应器中用胰蛋白酶水解牛血清白蛋白 ,考察了反应温度、底物浓度与酶用量等操作参数对水解度的影响规律。在此基础上 ,根据水解产物的相对分子质量分布将其归入四个集总组分 ,建立了此反应体系的四集总动力学模型。按照自下而上分层估算的原则 ,采用Marquardt法估算出反应网络中各反应的动力学常数。结果表明 ,产物空间体积的大小是影响反应速率的主要因素之一 ,动力学常数与温度的关系能较好地符合阿累尼乌斯关系式。经不同原料组成和反应条件的实验验证 ,各集总组分浓度的模型计算值与实验值较为吻合 。

黑眶蟾蜍皮肤白蛋白的纯化及胰蛋白酶抑制活性

[目的]探讨黑眶蟾蜍皮肤白蛋白的纯化及胰蛋白酶抑制活性。[方法]通过离子交换层析和凝胶过滤层析，从黑眶蟾蜍皮肤中得到其白蛋白，命名为BufomA-skin。65nmol／L的BufomA-skin分别与30nmol／Ltrypsin在25℃不同保温时间（0．25—24h）下测定胰蛋白酶抑制活性，计算剩余酶活力。[结果]BufomA-skin为单链蛋白，分子量约为66．7kDa。但在非还原状态下，50～66kDa条带呈弥散样。该蛋白有抑制胰蛋白酶水解小肽底物的活性，但对其他丝氨酸蛋白酶如凝血酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶及枯草杆菌蛋白酶无抑制。BufomA-skin与胰蛋白酶保温24h后，胰蛋白酶活性无恢复。[结论]黑眶蟾蜍皮肤白蛋白具有稳定的胰蛋白酶抑制活性，在黑眶蟾蜍防御天敌捕食的过程中发挥重要作用.

白蛋白信号肽引导天然N-端的rBPTI在毕赤酵母中高效分泌表达

目的:探讨在毕赤酵母(Pichia pastoris)中高效分泌表达具有天然N-端序列的rBPTI。方法:将白蛋白信号肽(hsasp)和bpti基因连接并构建真核表达载体pPICZ/hsasp-bpti,电击转化毕赤酵母菌株X-33,用PCR法、SDS-PAGE和胰蛋白酶抑制活性分析筛选阳性转化菌。结果:转染pPICZ/hsasp-bpti的毕赤酵母X-33工程菌能够高效地分泌表达rBPTI;培养上清中rBPTI含量约200 mg.L-1;SDS-PAGE和质谱分析结果显示rBPTI相对分子质量分别为6 500和6 508;rBPTI的N-端测序结果表明其N-端15个氨基酸序列与天然BPTI完全一致;胰蛋白酶活性抑制分析结果表明,抑制常数Ki=(2.6±0.1)×10-9,与天然BPTI一致。结论:hsasp能够在毕赤酵母中高效地引导分泌表达天然N-端氨基酸序列的rBPTI,其表达量达200 mg.L-1。

BrdU免疫组织化学染色方法的改进(漂片法)

目的改进用漂片法进行BrdU免疫组织化学染色时的封闭液,以减少组织切片破损。方法用5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU)标记大鼠踏转轮运动中所引起增殖细胞,通过ABC免疫组织化学方法染色。在染色过程中,比较不同的封闭液(羊血清、牛血清白蛋白、胰酶抑制剂)减少脑片破损的效果。结果踏转轮运动可使大鼠海马齿状回BrdU阳性细胞数明显多于对照组。加入不同的封闭液后,组织片破损率明显下降,尤其是加入牛血清白蛋白和胰酶抑制剂组,但胰酶抑制剂组有非特异性染色。结论牛血清白蛋白是较理想的封闭液。

血清SAA、CRP、PCT及TAP联合检测在急性重症胰腺炎早期诊治中的临床意义

目的分析急性胰腺炎患者血清中淀粉样蛋白A(SAA)、C反应蛋白(CRP)、血清降钙素原(PCT)及胰蛋白酶原激活肽(TAP)水平的变化,评价以上4项指标联合检测在急性胰腺炎诊治中的临床价值。方法 70例急性胰腺炎患者中重症急性胰腺炎组(SAP组)21例,轻症急性胰腺炎组(MAP组)49例,分别检测急性期患者体内PCT、SAA、CRP及TAP水平,并与50例健康对照进行比较。结果 SAP组与MAP组急性发作期患者血清PCT、SAA、CRP及尿TAP水平均与健康对照组不同,差异有统计学意义(P<0.01);SAP组血清PCT、SAA、CRP及TAP水平均明显高于MAP组,差异有统计学意义(P<0.01),4项指标联合检测效能高于单项指标检测。结论联合检测患者血清中SAA、CRP、PCT及TAP水平的变化,有助于急性胰腺炎的早期诊断及病情判断,对SAP的诊治具有重要意义。

啮齿类海马神经元的原代培养及方法改进

目的:通过对新生啮齿类海马神经元的分离和培养,尝试建立一个简单、稳定、高效的啮齿类海马神经元原代培养方法,为脊髓损伤的相关分子机制研究提供目的细胞。方法:取新生SD乳鼠的海马组织,通过低浓度胰酶消化制成细胞悬液、4h差速贴壁后使用无血清Neurobasal培养基培养,倒置显微镜观察细胞生长状态,免疫荧光对海马神经元相关微管蛋白-2(MAP2)行特异性染色,结合DAPI核染色鉴定神经元。结果:该方法培养的海马神经元生长状态良好,纯度较高。结论:采用低浓度胰酶消化,差速贴壁及无血清培养啮齿类海马神经元符合体外细胞实验要求,为进一步研究提供良好的目的细胞。

α胰蛋白酶H4重链在病毒性肝炎相关性原发性肝细胞癌早期预警中的价值

目的探讨α胰蛋白酶H4重链(inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain 4,ITIH4)在原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)早期预警中的价值。方法对肝硬化患者进行随访观察,检测发展为HCC的患者在随访前和确诊为HCC后血清中ITIH4浓度的动态变化。结果 109例肝硬化患者经过2年随访,共有29例发展为HCC(26.6%),ITIH4浓度在HCC组显著低于非HCC组(P=0.000),ROC曲线分析显示其对HCC进展预测的AUC为0.667,预测价值优于AFP。对发展为HCC患者血清动态样本进行检测,发现ITIH4在HCC进展过程中呈下降趋势(P=0.006)。结论 ITIH4具有HCC进展预警价值和动态监测作用,具有很好的应用前景。

大豆胰蛋白酶抑制因子对不同生长阶段小鼠体内自由基生成的影响

试验旨在研究胰蛋白酶抑制因子(STI)对不同生长阶段小鼠体内自由基生成的影响。选用180只清洁级昆明种雄性小鼠,按体重随机分为3组,第1组为对照组,饲喂基础日粮;第2组为STI组,饲喂含有STI的基础日粮;第3组为VC组,饲喂含STI+VC的日粮。饲养试验分别进行1、2、3、4和5周。试验期末,眼球采血制备血清,并且迅速取出胰腺进行氧化和抗氧化指标检测。结果表明:与对照组相比,STI组氧化指标水平显著增加,而抗氧化指标水平显著下降。随着STI饲喂时间的增加,STI组血清和胰腺中丙二醛(MDA)含量呈现先增加后下降趋势,且在第3周时升到最大值;抗超氧阴离子能力呈现先增加后下降,再增加又下降趋势;抑制羟自由基能力在整个生长周期内则呈现缓慢上升趋势。添加抗氧化剂后,氧化水平下降,但其值仍显著高于对照组(P<0.05)。随着饲养期的延长,血清和胰腺总超氧化物歧化酶(T-SOD)以及血清过氧化氢酶(CAT)活性呈现先降低后增加趋势,且最低点在第3周;胰腺CAT活性则呈现缓慢上升趋势。添加抗氧化剂后,抗氧化防御能力均增强,但仍低于对照组(P<0.05)。上述结果表明,STI对小鼠体内自由基水平的影响与生长周期有关,且在第3周时影响最为显著。此外,抗氧化剂维生素C的加入能够干预STI对机体的作用,有效改善氧化应激状态。

hs-CRP、LP-PLA2和TPS与高血压合并冠心病的相关性研究

目的探究超敏C反应蛋白(hs-CRP)、血清胰蛋白酶(TPS)、脂蛋白相关磷脂酶A2(LP-PLA2)与高血压合并冠心病的相关性。方法选取2015年11月至2017年11月该院收治的88例高血压合并冠心病患者作为高血压合并冠心病组,50例单纯高血压患者作为单纯高血压组。另选取50例健康体检人员作为对照组。采用高频超声测定颈动脉内膜中层厚度(IMT)并进行冠状动脉Gensini评分,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清hs-CRP、TPS、LP-PLA2水平并分析其与动脉IMT、Gensini评分的相关性。结果高血压合并冠心病组、单纯高血压组、对照组血清hs-CRP、TPS、LP-PLA2水平、颈动脉IMT及冠状动脉Gensini评分依次降低,差异均有统计学意义(P<0.05);血清hs-CRP、TPS、LP-PLA2与颈动脉IMT(r=0.654、0.537、0.556,P<0.05)和Gensini评分(r=0.875、0.954、0.756,P<0.05)呈正相关。结论高血压合并冠心病血清hs-CRP、TPS、LP-PLA2水平均高于单纯高血压患者与健康人群,与颈动脉IMT、Gensini评分均呈正相关提示其可能参与高血压合并冠心病的发生发展过程。

束缚应激大鼠血清淋巴细胞转化抑制因子的研究

为研究应激对淋巴细胞转化的影响,将 SD 大鼠四肢束缚于支架上,仰卧位,室温(20℃)下维持20h,对照组留置原饲养笼中,不予惊动。然后在乙醚轻麻下穿刺心脏取血,肝素化后密度梯度离心分离淋巴细胞,或待凝后分离血清。结果表明,应激大鼠外周血淋巴细胞对刀豆素(Con A)诱导的转化反应明显下降(p<0.01,n=8,ANOVA),而且应激大鼠血清可明显抑制正常小鼠淋巴细胞转化,这提示应激大鼠血清中可能存在某种具有抑制淋巴细胞转化的活性物质。进一步的分析实验表明,这种血清经加热56℃(30min),30%甲醇或透析(透析袋孔径阻滞分子量为6000)处理,抑制活性均不受影响;但经加热100℃(3min),80%甲醇或胰蛋白酶(64/μg/ml)处理,抑制活性丧失。提示这种抑制活性物质很可能是一类蛋白质。

新生大鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞的同时分离

背景:利用心肌组织中不同细胞的黏附特性差异,通过优化心肌细胞的培养条件,一次分离同时获得心肌和心肌成纤维细胞。目的:探讨新生大鼠心肌和心肌成纤维细胞同时分离的有效方法。方法:采用低浓度胰蛋白酶冷消化结合胶原酶复合消化,差速分离心肌和心肌成纤维细胞。通过使用不同种类的血清改良心肌细胞培养条件,免疫荧光鉴定心肌细胞和心肌成纤维细胞纯度。结果与结论:心肌培养48h时TroponinT阳性细胞率为89.3%。第2代的心肌成纤维细胞培养波形蛋白阳性细胞率为93.6%。含马血清的培养基组心肌细胞阳性率明显高于牛血清培养组(P<0.05)。实验应用的新生大鼠心肌细胞分离培养方法,心肌细胞和心肌成纤维细胞纯度高、活性好,且能同时获得心肌细胞和心肌成纤维细胞。

非洲爪蟾血清白蛋白的分离纯化及胰蛋白酶抑制活性

通过凝胶过滤层析及两步阴离子交换层析,从非洲爪蟾(Xenopus laevis)的血清中获得了其68kDa的血清白蛋白。与大蹼铃蟾血清白蛋白相似,非洲爪蟾血清白蛋白也具有抑制胰蛋白酶的活性,但其抑制活力相对较低,180nmol/L的非洲爪蟾血清白蛋白能抑制84%的胰蛋白酶活性(30nmol/L)。经表面等离子共振法获得了其与胰蛋白酶的结合动力学常数,解离平衡常数KD=1.44×10-6mol/L。经Western blot分析发现,非洲爪蟾的皮肤中也分布有血清白蛋白。推测两栖类动物血清白蛋白具有的胰蛋白酶抑制活性可能是其抵御天敌捕食的一种防御措施。

酶法获得的多肽库用于新型手性固定相的制备

采用胰蛋白酶酶解牛血清白蛋白,将制备的酶解液超滤,得到相对分子质量小于6 000的小分子多肽库。应用羰基咪唑法将该多肽库键合至多孔硅胶,得到一种新型手性固定相。应用该新型手性固定相成功地拆分了两种氨基酸对映体。

茶多酚对大豆胰蛋白酶抑制因子致小鼠胰腺氧化损伤的缓解作用

为研究茶多酚(TP)对大豆胰蛋白酶抑制因子(STI)致小鼠胰腺氧化损伤的缓解作用。试验设对照组(control组)、模型组(STI组,于日粮中添加3. 6 mg·g^(-1)的STI)、茶多酚组(TP组,于日粮中添加100. 0 mg·kg^(-1)的茶多酚和3. 6 mg·g^(-1)的STI)。第21天处死小鼠,研究处理组间胰腺和血清中丙二醛(MDA)、总抗氧化能力(T-AOC)、几种消化酶和激素含量的变化,并通过透射电镜观察胰腺超微结构变化。结果表明:与对照组相比,模型组小鼠胰腺和血清中的丙二醛、生长抑素(SS)、淀粉酶(AMS)、脂肪酶(LPS)含量均显著升高(P <0. 05),T-AOC、胰岛素(INS)和胰蛋白酶(TPS)含量显著降低(P <0. 05),线粒体损伤严重;而添加茶多酚的TP组较STI组,MDA、SS、AMS、LPS含量均显著降低(P <0. 05),T-AOC、INS和TPS含量显著升高(P <0. 05),线粒体有轻微损伤。表明茶多酚有效抑制了STI诱导的氧化应激,缓解了STI造成的胰腺氧化损伤。

茶多酚对大豆胰蛋白酶抑制因子诱导氧化应激的抑制作用

为研究茶多酚对大豆胰蛋白酶抑制因子(STI)诱导的小鼠氧化应激的抑制作用,设3个处理,每组12只清洁级雄性小鼠,第1组为正常对照组,饲喂基础日粮;第2组为模型组(STI组),饲喂添加STI的日粮,第3组为茶多酚组(TP组),饲喂添加STI和茶多酚的日粮。21 d后处死小鼠,测定其氧化及抗氧化指标的变化。结果表明:STI组小鼠由于STI诱导了氧化应激,造成胰腺和血清中的MDA含量均显著升高(P<0.05);而添加茶多酚的TP组,其胰腺中MDA含量较STI组显著降低(P<0.05),胰腺和血清中T-SOD、T-AOC、CAT、GSH和GSH-Px值较STI组均有不同程度的升高。研究表明,茶多酚有效抑制了STI诱导的氧化应激,削弱了自由基的氧化作用,并有效增强了机体的抗氧化能力。