转录组分析sgf73基因缺失对粟酒裂殖酵母生长代谢影响的分子机制

为研究粟酒裂殖酵母sgf73基因缺失后的关键基因和关键代谢通路,采用RNA-Seq测序技术对野生型酵母菌株及sgf73基因缺陷型菌株进行测序及生物信息学分析,并进行GO和KEGG功能富集分析.结果表明:sgf73基因缺陷型菌株中高表达基因有1834个,极高表达基因有6个,且有1714个差异表达基因,包括934个上调基因,780个下调基因;sgf73基因敲除导致细胞代谢和跨膜转运过程异常变化;MAPK信号通路中参与周期调控cki1,cki2和cdc25基因的下调导致sgf73Δ菌株有丝分裂时间延长;调控细胞骨架rgf2,rho1和stt4基因的下调导致sgf73Δ菌株肌动蛋白环收缩异常.

sgf73＋在裂殖酵母中的大规模遗传筛选

遗传相互作用(Genetic interaction,GI)直接提示了生物体内各个基因在功能上的关联性,为研究一个基因的潜在功能提供了线索。遗传筛选是研究基因遗传相互作用的重要方法。文章以SAGA(Spt-Ada-Gcn5 acetyltransferase)复合物去泛素化模块亚基基因sgf73+为查询基因,在裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中进行了大规模遗传筛选。结果显示,164个基因与sgf73+具有负遗传相互作用,42个基因具有正遗传相互作用。GO(Gene ontology)分析结果表明,这些基因富集于染色质修饰、DNA损伤修复、压力应答、RNA转录等生物过程。通过组蛋白修饰检测实验首次发现,sgf73+的缺失导致组蛋白H3K9、H4K16位点乙酰化水平下降,H3K4位点甲基化修饰水平上升。此外,系列稀释实验显示sgf73?菌株对DNA损伤试剂HU和CPT的敏感性提高,并且Sgf73参与高氧胁迫应答。这些结果显示sgf73+参与了染色质修饰、DNA损伤修复和高氧压力应答过程。

sgf73基因敲除对粟酒裂殖酵母细胞有丝分裂的影响

sgf73基因编码的Sgf73蛋白对SAGA复合物的功能具有重要作用。为探究sgf73基因缺失后sgf73Δ菌株有丝分裂中纺锤体、染色体、肌动蛋白的动力学变化,以粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)为材料,对sgf73Δ菌株进行生长曲线和减数分裂产孢实验;采用荧光蛋白标记和活细胞成像的方法,对sgf73Δ菌株有丝分裂进行观察。生长曲线结果分析发现,sgf73基因敲除极显著影响粟酒裂殖酵母的生长,并导致子囊孢子数目显著减少。活细胞成像结果分析发现,在有丝分裂间期,sgf73Δ菌株微管数量显著增加、微管长度趋于增长但无显著差异;sgf73Δ菌株在分裂期纺锤体出现组装缺陷,单极纺锤体极显著增加,前期和中期纺锤体伸长速率显著下降、后期纺锤体伸长速率极显著下降、分裂中期和后期时间分别显著和极显著延长,有丝分裂总时间极显著延长,细胞长度也增长。肌动蛋白分裂环在有丝分裂中维持及收缩时间出现极显著和显著延长,总速率显著降低。同时,染色体分离出现缺陷。以上结果表明,sgf73基因缺失会导致菌株微管、染色体、肌动蛋白缺陷。

裂殖酵母SAGA各亚基亚细胞荧光定位分析

SAGA(Spt-Ada-Gcn5 Acetyltransferase complex)是一个多亚基保守的转录复合物,在裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)里由19个亚基组成,调控体内10%基因的转录。文章通过构建原位整合荧光菌株,完整地分析了SAGA所有亚基的亚细胞荧光定位。荧光数据显示这些亚基的定位可分为4种类型,提示SAGA亚基除共同参与转录调控之外,可能还有其他功能。SAGA亚基Sgf73是联系去泛素化模块与SAGA其他模块的桥梁,它的缺失不仅明显减少了去泛素化亚基Ubp8、Sgf11、Sus1核内的定位,同时也影响了乙酰化亚基Gcn5、Sgf29、Ngg1以及核心结构亚基Spt7在细胞核内的定位,这提示Sgf73对维持SAGA的酶学功能和稳定性至关重要。另外,sgf73+的缺失还造成了胞质分裂的缺陷,导致细胞出现多核多膈膜表型。在△sgf73里过量表达膈膜降解途径中的关键基因ace2+和mid2+的回补结果表明,ace2+不能回补sgf73+缺失造成的缺陷,而mid2+也仅能部分回补,提示Sgf73可能还通过其他途径影响了胞质分裂。