TFEB基因shRNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的:构建TFEB基因的shRNA慢病毒载体,并鉴定是否成功。采用该载体包装的慢病毒侵染所获得的细胞系可利用TFEB(转录因子EB)作为靶点,用于TFEB相关性疾病发病机制的研究及为临床疾病研究提供新的药物治疗方向。方法:利用PCR、双酶切、连接、转化等分子生物学技术构建TFEB基因的shRNA慢病毒载体,利用测序鉴定序列是否连接成功;通过RNAi技术,将构建成功的重组质粒包装成慢病毒并侵染细胞,建立敲低TFEB的细胞系,利用Western blot检测侵染及对照HeLa细胞TFEB蛋白表达水平。结果:测序结果显示pLKO.1-TFEB-shRNA重组质粒分别包含3U、OR不同干扰序列,重组质粒构建成功;Western blot检测结果表明,序列为3U和OR的慢病毒收集液侵染的细胞内TFEB表达量均降低。结论:利用序列为3U和OR的shRNA构建的重组质粒、包装的慢病毒均成功,干扰了侵染获得的细胞系中TFEB的表达。

鞘内注射shRNA慢病毒载体缓解慢性炎性疼痛的机制研究

目的探究鞘内注射shRNA慢病毒载体对慢性炎性疼痛大鼠疼痛行为学及脊髓胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、OX42蛋白表达的影响。方法将54只SD大鼠随机分为正常组、空病毒组、慢病毒载体组,采用足底注射完全弗氏佐剂(CFA)建立大鼠慢性炎性疼痛模型,正常组大鼠足底注射生理盐水,鞘内注射PBS缓冲液;空病毒组和慢病毒载体组大鼠足底注射CFA,鞘内分别注射空病毒和慢病毒液。于建模前1 d及建模后第1、3、6、9、13天测量机械缩足阈值(PMWT)及热缩足潜伏期(PTWL);于建模后第3、6、13天留取大鼠L4~L5背根神经节(DRG)组织和脊髓节段组织,检测Nav1.7和GFAP、OX42蛋白表达水平。结果与正常组大鼠比较,空病毒组及慢病毒载体组大鼠PMWT值以及慢病毒载体组大鼠PTWL值在建模后第1天明显下降,在建模后第3天下降达最低值,之后逐渐升高;空病毒组PTWL值在建模后第1天明显下降,在建模后第3天下降达最低值,之后较第3天升高,但仍低于基础值。与空病毒组大鼠比较,慢病毒载体组大鼠PMWT、PTWL值从建模后第3天开始逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.05)。在建模后第3、6、13天,正常组大鼠DRG中Nav1.7及脊髓GFAP、OX42蛋白表达水平基本无变化;空病毒组和慢病毒载体组大鼠DRG中Nav1.7及脊髓GFAP、OX42蛋白表达水平较正常组增加,差异有统计学意义(P<0.05);慢病毒载体组大鼠DRG中Nav1.7及脊髓GFAP、OX42蛋白表达水平较空病毒组下降,差异有统计学意义(P<0.05)。结论鞘内注射shRNA慢病毒载体可抑制大鼠DRG中Nav1.7表达,抑制脊髓胶质细胞活化,下调GFAP、OX42蛋白表达,缓解大鼠慢性炎性疼痛。

靶向PD-1的shRNA慢病毒载体的构建

目的:设计以PD-1基因为靶点的短发夹状RNA(shRNA),构建重组慢病毒载体,鉴定此RNA干扰系列对PD-1基因表达的影响,从设计序列中筛选高(>90%)干扰效率的靶点序列(PD694/791)。方法:设计合成3种PD-1的shRNA干扰序列,与LV3载体连接,进行阳性鉴定,通过免疫印迹法(western)和阳性细胞数量检测筛选高干扰效率靶序列。结果:基于转染目的细胞的PD-1蛋白western检测结果,计算三种shRNA慢病毒载体的干扰效率分别为:PD791干扰效率为78%、PD 238干扰效率为8%、PD 694干扰效率88%。结论:成功构建靶向PD-1的shRNA慢病毒载体,其中干涉片段PD694和PD791对PD-1的干涉抑制效果显著,可以有效抑制原代T细胞PD-1表达,为研究开发PD-1抑制剂治疗肿瘤奠定基础。

FoxM1 shRNA慢病毒载体构建及感染人前列腺癌细胞的稳定细胞株筛选

目的构建携带绿色荧光蛋白(GFP)的人Fox M1 sh RNA重组慢病毒载体,并构建筛选Fox M1敲低的人前列腺癌稳定细胞株,检测Fox M1的表达及对细胞增殖能力的影响。方法设计并合成3对特异性针对人Fox M1基因的sh RNA靶序列,构建到p HBLV-U6-Zs Green-Puro慢病毒载体中,测序鉴定载体构建情况,利用慢病毒三质粒系统转染包装293T细胞,荧光显微镜下观察转染效率。收集到的病毒上清转染人前列腺癌DU-145细胞,Real-time PCR检测各组细胞Fox M1 m RNA水平,经嘌呤霉素筛选建立Fox M1敲低稳定细胞株,用Western blotting法检测细胞中Fox M1表达,并用MTT法观察稳转细胞的生长增殖活性,流式细胞术观察稳转细胞凋亡情况,平板克隆实验观察稳转细胞的克隆形成能力。结果经测序鉴定成功构建了3对Fox M1sh RNA慢病毒载体,并进行包装,感染DU-145细胞后Real-time PCR检测结果表明第1对慢病毒载体干扰效率最佳,嘌呤霉素抗性筛选建立了Fox M1敲低稳定细胞株,荧光显微镜观察感染效率较高,Western blotting结果显示细胞中Fox M1蛋白表达明显受到抑制,细胞的生长增殖能力明显受限,流式细胞术结果显示Fox M1敲低组细胞凋亡率高于对照组,平板克隆实验结果表明Fox M1敲低组细胞克隆形成能力下降。结论本研究成功构建了Fox M1 sh RNA慢病毒载体,建立了Fox M1敲低稳定前列腺癌细胞株,抑制细胞内Fox M1的表达能够抑制前列腺癌细胞DU-145的生长增殖、克隆形成能力,并能诱导细胞凋亡。

CDK2 shRNA慢病毒载体的构建及其基因沉默效应

目的构建CDK2 shRNA慢病毒载体,并在黑色素瘤细胞B16-F1中鉴定其基因沉默效应。方法体外构建3个慢病毒重组目的质粒p UL-CDK2-shRNAs和1个阴性对照慢病毒重组质粒p UL-NC-shRNA,转化感受态细胞,PCR鉴定后进一步测序验证;293T细胞中测定病毒滴度;用重组慢病毒感染B16-F1细胞测定其感染效率,RT-PCR和Western印迹检测其对B16-F1细胞中CDK2的基因沉默效应。结果 PCR鉴定后进一步测序表明,成功构建了重组慢病毒质粒;病毒滴度为4.5×107~5.5×107TU/ml;用重组慢病毒感染B16-F1细胞,当感染复数(MOI)为10时,感染效率可达90%;RT-PCR和Western印迹结果表明,与未感染组和NC-shRNA感染组细胞相比,CDK2-shRNA1、CDK2-shRNA2、CDK2-shRNA3感染的细胞中CDK2 mRNA和蛋白表达均受到不同程度抑制(P<0.05),以CDK2-shRNA3感染组的抑制率最高,RT-PCR和Western Blot检测其抑制率分别为78.5%±4.23%和70.5%±3.54%。结论利用RNAi技术成功构建了3种CDK2-shRNA重组慢病毒载体,均可有效感染B16-F1细胞并具有一定的基因沉默效应,其中以针对靶位点1012-1020的p UL-CDK2-shRNA3基因沉默效应最强,为进一步研究CDK2基因沉默对黑色素瘤化疗敏感性的影响奠定了基础。

S100P shRNA慢病毒载体的构建及其对胃癌MGC-803细胞生物学行为的影响

目的:构建针对S100P基因的shRNA慢病毒载体,并在胃癌MGC-803细胞上鉴定沉默效率,观察其对细胞生物学行为的影响。方法:筛选的S100P基因特异性siRNA靶点,合成短发卡结构shRNA,并与GV115-GFP慢病毒载体重组形成shRNA表达载体,与p Helper 1.0和p Helper 2.0质粒共转染293T细胞,产生慢病毒。用病毒感染MGC-803细胞,RT-PCR和Western blot检测靶基因的沉默效率、克隆形成情况、细胞周期变化和凋亡实验观察靶基因沉默对MGC-803的影响。结果:构建的重组shRNA慢病毒载体,经293T细胞包装获得病毒颗粒,和阴性对照相比,慢病毒感染组S100P mRNA表达下降了83.4%,蛋白表达也明显受到抑制。S100P沉默后MGC-803的克隆形成能力明显减弱,细胞周期发生S期阻滞,细胞凋亡明显增加。结论:成功地构建了S100P基因shRNA慢病毒表达载体,该载体能够在MGC-803细胞中沉默S100P基因的表达,导致胃癌细胞克隆形成能力降低,细胞周期阻滞,诱导细胞凋亡,表明S100P基因有可能具有影响胃癌发生发展的作用。

人HMGN5基因shRNA慢病毒载体构建与RNAi效率的鉴定

目的构建人HMGN5基因的shRNA慢病毒载体并鉴定在肺癌A549和H1299细胞上的沉默效率。方法设计HMGN5基因特异性siRNA靶点,构建于慢病毒pLL-3.7载体,并筛选获得有效的shRNA慢病毒载体,在293T细胞包装成病毒颗粒,将其感染肺癌A549和H1299细胞,应用Real-time PCR方法从mRNA水平上检测HMGN5的沉默效率。结果构建的慢病毒载体shRNA的PCR鉴定和测序正确,包装病毒后滴度达到5×108TU/ml。shRNA慢病毒颗粒感染A549和H1299细胞后HMGN5基因的mRNA表达量较阴性对照载体慢病毒感染组分别下降了71.7%和50.7%。结论成功构建了HMGN5基因的shRNA慢病毒表达载体,在分子水平能够有效沉默靶基因,为探讨HMGN5在肿瘤基因治疗中的作用奠定了基础。

mTOR shRNA慢病毒载体的构建及包装

目的:构建mTOR shRNA慢病毒表达载体,为探讨RNA干扰技术抑制T细胞mTOR基因的相关研究奠定基础。方法:设计合成针对小鼠mTOR基因的shRNA片段,与酶切后的pLKD.UBC.GFP.U6载体片段进行连接并转化DH5α,提取阳性克隆质粒,测序,转染293T细胞。通过GFP表达水平测定病毒滴度。结果:DNA测序结果及PCR鉴定证实成功构建小鼠mTOR-shRNA重组慢病毒载体,对其进行包装后测定慢病毒滴度为1.38E+08 TU/ml。结论:成功构建并包装小鼠mTOR-shRNA重组慢病毒表达载体。

REST/NRSF基因shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

背景:神经元限制性沉默因子(REST/NRSF)能负向调控神经元及胰岛细胞分化相关基因的表达。目的:构建并筛选能高效沉默大鼠REST/NRSF基因的shRNA慢病毒载体。方法:针对REST/NRSF基因设计4组特异性siRNA靶点,合成靶序列的寡核苷酸序列,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ和XhoⅠ双酶切后的pFU-GW-RNAi载体连接产生L-shREST/NRSF慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。包装产生慢病毒颗粒,随后将其感染大鼠骨髓间充质干细胞,采用Real-timePCR方法检测靶基因在mRNA水平的沉默效率。结果与结论:PCR和测序证实,构建出了REST/NRSFshRNA的慢病毒载体L-shREST/NRSF,并能稳定转染大鼠间充质干细胞,感染效率达100%。4组shRNA序列均有基因沉默效果,并以第3组shRN序列效果最为明显。结果表明,该慢病毒表达载体能够在细胞水平有效沉默靶基因。

Oct4-shRNA慢病毒载体沉默结直肠癌Oct4基因并诱导细胞凋亡的初步研究

目的:探讨Oct4-shRNA慢病毒载体对人结直肠癌SW480细胞Oct4的抑制效率及对细胞凋亡的影响。方法:构建针对Oct4的4对Oct4-shRNA干扰慢病毒载体质粒,用Oct4与GFP融合的过表达质粒分别与4个干扰质粒共转染293T细胞,采用Western blot检测GFP的表达,筛选出干扰效果最好的Oct4-shRNA慢病毒载体,用293T细胞包装后转染SW480细胞,实时荧光定量PCR和Western blot检测Oct4的表达情况,流式细胞仪测定细胞凋亡。结果:与转染阴性对照病毒的对照组相比,转染Oct4-shRNA慢病毒载体的SW480细胞Oct4的mRNA和蛋白表达明显降低(P<0.01);细胞凋亡明显增加(P<0.01)。结论:Oct4-shRNA慢病毒载体可有效抑制SW480细胞Oct4表达,并显著增加细胞凋亡。

人核因子-κBp65 shRNA慢病毒载体构建及对肺癌细胞恶性生物学行为的影响

背景与目的核因子-κB作为重要转录因子,与多种恶性肿瘤的发生发展有着密切联系,直接或间接抑制NF-κBp65的表达可逆转肿瘤细胞生物学行为。构建人核因子-κBp65基因shRNA重组质粒,感染A549细胞并筛选出稳定细胞株,对其迁移、粘附能力进行鉴定。方法设计并合成人核因子-κBp65的乱序对照序列(scramble)和干扰序列(shRNA)构建重组质粒,在5’端引入一个BamHI位点,3’端引入一个XhoI位点和EcoRI位点;感染A549细胞并由嘌呤霉素做稳转株的筛选;应用Western blot、qRT-PCR技术检测NF-κBp65的干扰效果及IκBα蛋白表达水平的变化;Transwell、MTT法分析其对A549细胞迁移、粘附能力的影响。结果成功构建重组质粒并筛选出A549/NF-κB p65scramble稳转株和A549/NF-κB p65 shRNA稳转株;A549/NF-κB p65 shRNA稳转细胞株与A549/NF-κB p65 scramble稳转细胞株及A549细胞相比NF-κBp65的mRNA、蛋白表达水平均下调;IκBα蛋白水平明显下调;细胞迁移能力及粘附能力均降低。结论本实验通过RNA干扰技术构建的重组慢病毒可有效抑制NF-κBp65 mRNA和蛋白的表达水平;抑制NF-κBp65可明显降低A549细胞的迁移和粘附能力。

靶向Rap1b基因shRNA慢病毒载体的构建及其对食管鳞癌细胞Rap1b基因表达的沉默

目的:设计以Rap1b基因为靶点的短发夹状RNA(shRNA),构建重组慢病毒表达载体并转染食管鳞癌细胞,观察其在食管鳞癌细胞中的表达。方法:应用重组DNA技术,将设计好的4条基因特异性shRNA序列插至慢病毒表达载体pGLV3-GFP中,构建pGLV3-GFP-Rap1b-shRNA1/2/3/4。并应用脂质体法转染293T细胞,进行病毒包装及滴度测定。采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)及Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测转染食管鳞癌细胞株Eca109后Rap1b基因的表达情况。结果:测序证实慢病毒载体构建成功,并测定滴度为1×109TU/ml,pGLV3-GFP-Rap1b-shRNA3/4转染后72h和96h均可显著抑制Rap1b基因mRNA及蛋白的表达。结论:成功构建Rap1b基因的shRNA慢病毒载体,所介导的RNAi能有效抑制食管鳞癌细胞Eca109中Rap1b基因的表达。

CD47-shRNA慢病毒载体构建及其介导Hep-2细胞CD47基因沉默效应鉴定

目的构建CD47靶向shRNA慢病毒干扰载体,并观察其对Hep-2细胞CD47基因的抑制效应。方法设计CD47靶点特异性的寡核苷酸序列,利用酶切反应合成含特异性系列线性化的pGCSIL-GFP载体,包装293T细胞产生慢病毒并行滴度测定,再转染人喉癌Hep-2细胞,通过实时荧光定量PCR及Western Blotting检测重组慢病毒对CD47靶基因在mRNA和蛋白水平上的沉默抑制情况。结果阳性克隆PCR及测序证实针对CD47基因shRNA慢病毒干扰载体构建成功,RT-PCR及Western Blotting检测载体在mRNA和蛋白水平上可抑制喉癌Hep-2细胞的CD47表达。结论成功构建针对CD47基因的慢病毒干扰载体,为进一步行喉癌CD47基因功能研究提供了较好的实验工具。

凋亡蛋白抑制因子Livin shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定凋亡蛋白抑制因子Livin基因短发夹状干扰RNA(shRNA)慢病毒载体,以便进一步研究Livin的功能。方法针对已经筛选确定的Livin基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经HpaI和XhoI酶切后的pGCL-GFP载体[含U6启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接、转化,产生pLV-shLivin慢病毒表达载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用pLV-shLivin,pHelper1.0和pHelper2.03种质粒共转染包装细胞人胚肾293T细胞,包装产生重组慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度。结果PCR和测序证实,成功构建Livin shRNA的慢病毒载体LV-shLivin。包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为3×108TU/ML。结论成功构建Livin基因shRNA慢病毒载体,为应用RNAi研究Livin功能奠定基础。

Beclin-1基因shRNA慢病毒载体的构建及其对B16F10细胞自噬及活力的影响

利用RNA干扰技术构建稳定沉默Beclin-l基因的B16F10小鼠黑色素瘤细胞系,分析稳转细胞系的自噬水平和活力,为探讨Beclin-1基因、自噬与肿瘤三者关系奠定基础。构建小鼠Beclin-l基因干扰载体,转染至293T细胞,获得慢病毒颗粒,将病毒颗粒感染B16F10细胞,通过加压筛选、有限稀释、细胞驯化得到稳定转染m-Beclin-1-shRNA1的B16F10细胞系。采用RT-PCR和免疫荧光技术检测对Beclin-l的干扰效果,Western blot和透射电镜分析稳转细胞系中自噬标志物LC3蛋白表达及自噬小体形成情况,CCK-8法检测稳转细胞系的活力。结果表明,成功构建了靶向抑制Beclin-l基因表达的shRNA,纯化的慢病毒滴度为1×10^(8) TU·mL^(-1),建立的细胞系中Beclin-1 mRNA和蛋白表达都受到不同程度的抑制,mRNA的沉默效率约为75%(P<0.01),发现干预Beclin-1表达能够抑制LC3-Ⅱ蛋白的表达及自噬小体的形成数量,降低B16F10细胞活力。以上结果表明,干扰Beclin-1表达能够有效降低B16F10细胞自噬活性,促进B16F10细胞死亡,这为探讨Beclin-1基因功能及自噬在抗肿瘤中的作用奠定重要基础。

靶向TIPE2基因的shRNA慢病毒载体构建及病毒包装

目的包装表达TIPE2-shRNA的慢病毒颗粒。方法查询并合成7对针对TIPE2的shRNA序列,将其克隆入pLK0.1载体,经酶切及测序正确后,将构建好的7种pLKO.1-TIPE2-shRNA质粒分别与pCDNA3.1/3×FLAG-TIPE2共转染293T细胞,Western blot鉴定干扰效率并进行后续的病毒包装。结果 4号质粒沉默效果最好,将其与Non-target-shRNA质粒分别进行病毒包装,Western blot和免疫荧光证实病毒具有良好的感染效率和沉默效果。结论 TIPE2-shRNA的慢病毒载体构建及病毒包装成功。

USP22 ShRNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建并鉴定USP22基因Sh RNA慢病毒载体,为进一步研究USP22基因在鼻咽癌中的作用机制奠定基础。方法针对USP22基因的编码序列设计并合成2条特异性干扰序列,序列两端含有限制性内切酶位点HpaⅠ和XhoⅠ。寡核苷酸链退火生成寡核苷酸双链,5′端磷酸化后将含有酶切位点的寡核苷酸双链克隆到p LL3.7慢病毒表达载体。连接产物经转化、培养,提取其质粒,提取出来的质粒经HpaⅠ和XhoⅠ酶切电泳鉴定,鉴定正确的质粒进行测序。构建成功的慢病毒表达载体p LL-USP22-sh RNA与包装载体质粒混匀共转染于293T细胞。通过荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)情况,对病毒滴度和感染效率进行检测。结果成功构建慢病毒表达载体p LL-USP22-sh RNA。与包装载体质粒共转染293T细胞后测定慢病毒滴度为4×107 TU/ml。结论本实验应用相关技术成功构建USP22 Sh RNA慢病毒载体,为进一步研究USP22基因的生物学功能奠定了基础。

PGC-1α-shRNA慢病毒载体对牙髓干细胞分化的影响

目的:构建过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(peroxisome proliferators activated receptor γ coactivator 1α,PGC-1α)短发夹RNA(short hairp in RNA,shRNA)慢病毒表达载体,体外评价其对牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSC)分化的影响。方法:根据shRNA设计原则,设计合成用于体内干扰PGC-1α编码序列的shRNA,重组入慢病毒载体PLKO.1。将构建正确的PLKO.1/PGC-1α-shRNA感染DSPC,实时荧光定量PCR检测PGC-1α的表达,细胞化学染色和实时荧光定量PCR检测其对DPSC分化的影响。结果:测序证实重组质粒构建成功;体外试验表明,DPSC转染了PGC-1α-shRNA后PGC-1α表达水平降低,干扰效率达81%,而且细胞钙化结节增多,牙本质涎磷蛋白和Ⅰ型胶原的表达明显上调,与对照组相比具有显著性差异(P<0.05)。结论:慢病毒介导的PGC-1α-shRNA成功在体外抑制了目的基因的表达,并影响牙髓干细胞的分化。

新型shRNA慢病毒载体抑制TGIF表达及对TGF-β通路的调节

目的构建针对同源域蛋白TGIF(5′-TG-3′interacting factor)可诱导表达shRNA的慢病毒载体,鉴定其在大肠癌细胞系DLD1中对TGIF的基因沉默效率,进一步研究其对TGF-β信号通路下游基因的影响。方法设计并合成针对TGIF的RNA干扰序列,克隆到可被强力霉素诱导的新型Tet-on慢病毒载体,将慢病毒颗粒感染大肠癌细胞系DLD1细胞。培养并分离细胞克隆后,使用强力霉素(doxcycline)进行诱导,用Real-Time PCR和Western印迹法检测TGIF和PAI-1的表达情况。结果构建了针对TGIF可诱导shRNA的真核表达病毒载体并获得相应的病毒,病毒可以高效感染大肠癌细胞系DLD1。在强力霉素诱导下,TGIF在DLD1细胞系的表达得到有效抑制,TGF-β下游基因PAI-1和p15表达明显升高。结论本研究成功构建了可诱导表达shRNA慢病毒载体,其在强力霉素诱导下可以有效抑制TGIF在大肠癌细胞系内的表达;TGIF可以抑制TGF-β信号传导通路。

SET基因shRNA慢病毒载体的构建及其在肝细胞中的表达鉴定

目的:构建SET基因shRNA慢病毒表达载体,为研究SET在三氯乙烯毒性机制中的作用提供技术支持。方法:通过NCBI检索SET序列,设计合成5对shRNA片段,退火后连接到慢病毒载体pLVX-shRNA1 vector。挑取筛选的单菌落,经PCR和测序鉴定后提取质粒。将质粒共转染到293T细胞,收集病毒上清,转导入L-02肝细胞中,利用嘌呤霉素筛选得到SET缺陷型细胞,最后利用荧光定量PCR和Western blot鉴定干扰效果。结果:PCR和测序结果证明双链shRNA正确插入慢病毒载体pLVX-shRNA1 vector,共转染293T细胞得到高滴度病毒,转导L-02细胞筛选出SET基因缺陷型细胞。结论:利用慢病毒介导的RNAi技术成功构建了SET基因缺陷型细胞。