Differential Proteomic Analysis of Carbon Ion Radiation in Sheep Sperm

This study is first to investigate proteomic changes in sheep sperm induced by carbon ion radiation using two-dimensional electrophoresis （2-DE） analysis in the project of breeding a new variety of sheep. Differential expression proteins were detected using the PDQuest 8.0 software after staining with Coomassie blue. Valid spots were then analyzed through liquid chromatography tandem mass spectrometry （LC-MS/MS）. Among the 480 total protein spots displayed in 2-D gels, 6 specific protein spots were observed in sperm gels. A search against protein sequences in the National Center for Biotechnology Information databases （NCBI） indicated that differentially expressed proteins correspond to two proteins, identified to be enolase and transcription factor AP-2-alpha （TFAP-2c0. The two proteins were up-regulated in the irradiated sperm. To the best of our knowledge, this study is the first to identify proteomic changes induced by carbon ion radiation in sheep sperm. The analysis of differential expression protein may be useful in identifying new breeding markers in sheep reproduction and in clarifying the mechanisms involved in irradiation or space breeding.

Effect of Wild Marjoram (<i>Origanum vulgare</i>) Plant Extracts on Capacitation of Sheep Spermatozoa <i>in Vitro</i>

The purpose of this study was to evaluate the effect of the addition of Origanum vulgare extract to in vitro capacitation sperm medium (IVCSM). This study investigated the antioxidant and antimicrobial effects of O. vulgare extracts at different concentrations (0.3, 0.6, 1.2 μg/ml and 25.0, 50.0, 100.0 μg/ml, respectively) in IVCSM. Significant enhancements in semen quality parameters such as total motility, live and live capacitated sperm were found when O. vulgare extract was added as an antioxidant source (1.2 μg/ml). The treatment of spermatozoa with O. vulgare extract at the highest concentration (100 μg/ml) for 2 hrs without antibiotics improved sperm characteristics. In conclusion, incubation of sperm with O. vulgare extract in capacitation medium had beneficial effects on the characteristics of ram sperm.

大豆卵磷脂对绵羊精液低温保存效果的影响

为了研究大豆卵磷脂对绵羊精液低温保存效果的影响,在杜泊绵羊精液稀释液中分别添加0(对照)、1.875、3.750、7.500、15.000 g/L大豆卵磷脂,在4℃条件下进行低温保存,每隔12 h观察一次精子活率,统计精子有效存活时间和总存活时间,检测第48小时精子的畸形率和顶体完整率。结果表明,1.875 g/L组的精子有效存活时间、总存活时间显著高于对照组和其余各试验组(P<0.05);1.875 g/L组的精子顶体完整率显著高于15.000 g/L组(P<0.05),畸形率显著低于15.000 g/L组(P<0.05)。说明在稀释液中添加1.875 g/L的大豆卵磷脂可以延长精子的存活时间,提高绵羊精液低温保存的质量。

东北地区秋季饲喂赖氨酸锌对湖羊种公羊血浆生化指标与精子质量的影响

[目的]试验旨在研究东北地区秋季饲喂赖氨酸锌对湖羊血浆生化指标与精子质量的影响。[方法]选择体况良好的1~2岁湖羊种公羊32只随机平均分为4组,分别补饲0、25、50、100 mg/d赖氨酸锌。试验于2022年8月至2022年10月在黑龙江伊春开展,平均气温10.3℃。试验预试期7 d,正试期56 d。分别于试验第28、42及56天采集湖羊颈静脉血,测定血浆睾酮、褪黑素、白细胞介素-2、白细胞介素-4、白细胞介素-6、白细胞介素-10、促肾上腺皮质激素和肿瘤坏死因子-α水平,以及血浆总抗氧化能力、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性及丙二醛水平。采集湖羊精液测定精子活率、质膜完整率及畸形率。[结果]第28天时50 mg/d组湖羊褪黑素水平显著高于0及100 mg/d组(P<0.05),总抗氧化能力显著高于0 mg/d组(P<0.05),白细胞介素-4水平显著低于25 mg/d组(P<0.05),白细胞介素-10水平显著低于0 mg/d组(P<0.05)。第42天时50 mg/d组湖羊超氧化物歧化酶活性显著高于0 mg/d组(P<0.05),白细胞介素-4水平显著低于其他各组(P<0.05),促肾上腺皮质激素水平显著低于0及100 mg/d组(P<0.05)。第56天时50 mg/d组湖羊精子质膜完整率显著高于0 mg/d组(P<0.05),超氧化物歧化酶活性显著高于0 mg/d组(P<0.05),白细胞介素-4水平显著低于0及100 mg/d组(P<0.05)。[结论]补饲赖氨酸锌能够改善东北地区秋季湖羊种公羊血浆生殖激素水平、抗氧化能力、免疫指标水平与精子质量,建议补饲量为50 mg/d。

α-酮戊二酸对湖羊精子质量与血浆生化指标的影响

试验旨在研究东北地区秋季饲喂α-酮戊二酸对湖羊精子质量与血浆生化指标的影响,选择体况良好且体重相近的湖羊32只,随机平均分为4组,分别按只补饲0、5、10、20 g/dα-酮戊二酸。试验于8—10月在黑龙江伊春市开展,平均气温10.3℃。预试期7 d,正试期56 d。分别于试验第28、42、56天采集湖羊颈静脉血,评估血浆睾酮、褪黑素、白细胞介素(2、4、6、10)、促肾上腺皮质激素、肿瘤坏死因子-α、丙二醛水平、总抗氧化能力及抗氧化酶活性。采集湖羊精液检测精子活率、精子质膜完整率及精子畸形率。结果表明:α-酮戊二酸对湖羊精子畸形率、血浆睾酮、白细胞介素(2、6、10)水平无显著影响(P>0.05)。每只湖羊补饲20 g/dα-酮戊二酸显著提高了精子活率、精子质膜完整率、血浆褪黑素水平、总抗氧化能力及超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶及过氧化氢酶活性(P<0.05),同时显著降低了血浆丙二醛、促肾上腺皮质激素、白细胞介素-4及肿瘤坏死因子-α水平(P<0.05)。说明东北地区秋季每只湖羊补饲20 g/dα-酮戊二酸能够改善精子质量、血浆生殖激素水平、抗氧化能力与免疫指标水平。

绵、山羊性控精液的制作技术与应用研究进展

绵、山羊性控精液的生产与应用大大提高了群体扩繁的效率,推动了羊产业快速发展。自性控精液技术发展以来,研究者们虽取得了一定的科研成果,但在羊生产中的应用仍然十分有限。本文系统综述了羊性控精液分离技术的发展及不同因素(包括品种、个体差异、稀释液配方、冷冻程序、饲养管理)对绵、山羊性控精液制作的影响,并阐述了羊性控精液的推广应用及前景展望,为绵、山羊性控精液高效分选、输精技术的研发及推广应用提供参考。

定时输精技术对奶绵羊批次受胎率影响的研究

[目的]探究定时输精技术在奶绵羊批次化生产中的应用效果。[方法]选定甘肃地区奶绵羊规模养殖场的经产母羊先进行疾病检测,合格后开展定时输精试验。2022年7—12月,根据羊场存栏实际情况以及生产安排,开展了5个批次、210只羊的同期发情+查情输精模式试验和26个批次、1290只羊的定时输精模式试验,统计各个批次的受胎率。[结果]5个批次的同期发情+查情输精模式的平均参配率为90%,平均参配受胎率为82%,而平均批次受胎率仅有74%;而26个批次的定时输精模式的批次受胎率为84%,羊群利用率提升了10%。[结论]定时输精模式免查情,可降低工作强度,提升批次受胎率;同时有效提高母羊利用率和配种工作效率,降低羊场生产成本。批次受胎率比参配受胎率更能衡量配种工作的真实效率。

不同品种绵羊的细管冻精解冻质量检测分析

选取8个不同品种羊(引进品种2个,本地品种4个,培育品种2个)的细管冻精,进行外观、剂量、精子活力、前向运动精子数和精子顶体完整率指标的检测分析。结果显示,各细管冻精外观均完好,符合生产标准;剂量检测值为(0.21±0.01) mL,均符合国家标准(≥0.18 mL);精子活力为(37.50%±1.70%)~(51.0%±3.70%),其中,陶赛特羊精子活力值最高,黑裘皮藏羊精子活力值最低;前进运动精子数为≥3×10^(7)个,符合国标;精子顶体完整率为(71.90%±1.13%)~(81.23%±1.0%),其中,西藏(草地型)羊精子顶体完整率最高,陶赛特羊精子顶体完整率最低。8个品种的羊冻精在解冻复苏后各项指标均达到配种生产要求。引进品种的精子活力比本地品种高,前进运动精子数和顶体完整率等其他指标有高有低。

烟酸通过降低氧化应激水平提高绵羊精子低温保存效果

低温保存可有效延长精子体外保存时间,提高精液利用效率。但是长时间处于低温环境下会造成活性氧(reactive oxygen species,ROS)持续累积,诱发精子氧化应激,降低质膜完整性,造成精子活力下降。旨在研究绵羊精子4℃保存条件下,稀释液添加不同浓度烟酸(nicotinic acid,NA)对精子的保存效果,并探讨其作用机理。采集健康的成年德国美利奴种公羊精液(n=6),以基础稀释液中添加5、10、20 mmol·L^(-1)NA为保护剂,拟阐明NA对绵羊精子的保护作用。通过精子分析仪检测精子活力、运动性能,精子低渗膨胀试验检测质膜完整性,荧光染色检测精子中ROS水平、线粒体功能,试剂盒检测H_(2)O_(2)含量、抗氧化因子活性水平及ATP水平。结果表明:与10%BSA对照组相比较,添加NA处理后精子的存活时间可延长至120 h,其中10 mmol·L^(-1)NA NA处理后第72小时精子活力仍可达到70%以上;在NA处理后24~72 h时,绵羊精子可保持更高的活力、运动性能与及质膜完整性(P<0.05),而且降低了精子中的ROS水平(P<0.05)。在NA处理后第72小时,精子中H_(2)O_(2)含量显著低于10%BSA对照组(P<0.05),而精子中抗氧化因子(CAT、GSH-PX、T-SOD、T-AOC)活性水平、线粒体功能以及ATP水平均显著优于10%BSA对照组(P<0.05)。综上,在4℃保存条件下,绵羊精液低温稀释液中添加NA,可提高精子的活力、运动性能、质膜完整性和抗氧化能力,并改善精子线粒体功能和ATP生成,有效提升绵羊精子低温保存效果。

获能前后绵羊精子的差异蛋白质组学分析

为了探索获能前后绵羊精子蛋白质的动态变化,通过串联质谱标签结合液质联用分析技术,对获能前后绵羊精子的总蛋白进行定量分析。结果显示:获能前后绵羊精子的差异表达蛋白共有203个,获能后表达上调蛋白质27个,表达下调蛋白质176个。差异表达参与解剖结构发育、生殖等生物学进程;从细胞组分看,差异表达蛋白定位在细胞溶质、质膜中;从分子功能看,主要参与氧化还原等过程。差异表达蛋白也参与蛋白酶体、Hedgehog和cAMP等信号通路。通过差异蛋白表达结合文献分析,筛选出乳铁蛋白。Western blot结果表明,乳铁蛋白在绵羊精子中存在,且在获能后表达量极显著降低(P<0.0001);RT-qPCR结果表明,乳铁蛋白在获能前后绵羊精子中均存在,且差异极显著(P<0.001),说明乳铁蛋白对绵羊精子获能有一定的影响。

不同浓度大豆卵磷脂替代蛋黄对东佛里生奶绵羊精液冷冻保存效果的影响

本试验皆在研究添加不同浓度大豆卵磷脂(SL)冷冻保存东佛里生奶绵羊精液的效果。我们在Tris基础稀释液中,添加18%蛋黄为对照组,添加0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%SL设为试验组,检测冷冻精液解冻后的精子活率和顶体完整率。结果显示,添加0.5%、2.5%SL冷冻稀释液稀释的精液,解冻后精子活率和顶体完整率与其他组之间存在显著差异(P<0.05);添加18%蛋黄和1%~2%SL冷冻稀释液稀释的精液,冷冻解冻后精子活率和顶体完整率之间无显著差异(P>0.05);添加18%蛋黄和1.0%~1.5%SL冷冻稀释液稀释后的精液,进行人工授精后母羊的妊娠率与对照组无显著差异(P>0.05)。因此,大豆卵磷脂可以作为冷冻保护剂用于东佛里生奶绵羊精液的冷冻保存,其最佳添加浓度为1~2%(g/L)。

电刺激器法在西藏色瓦绵羊人工采精中的应用试验

西藏色瓦绵羊是藏北特有草地型绵羊,由于自然交配情况下种公羊利用率低,需要利用人工授精方式来提高种公羊利用率以加快遗传改良进程,本研究旨在西藏色瓦绵羊上运用电刺激采精法寻求最佳采精刺激电压并结合按摩法以获得较好的色瓦绵羊种公羊人工采精效果。试验采用电刺激方法采集西藏色瓦绵羊种公羊精液,对采精时不同电压、按摩结合电刺激采精以及两次连续采精条件下所获得的精液进行品质检测。结果表明:电压在1~3 V和9~15 V时西藏色瓦绵羊种公羊无法采集到精液,在电压为5 V和7 V时公羊阴茎勃起并射精但其射精量、精子密度、精子活力无显著性差异(P>0.05);并且发现单纯使用电刺激和结合按摩所采集出的精液在精液量、精子密度、活力无显著性差异(P>0.05),但是射精时间有显著差异(P<0.05);在间隔30 min进行两次连续采精时第1次采精的采精量、精子密度均显著优于第2次的(P<0.05),活力无显著性差异(P>0.05)。说明西藏色瓦绵羊公羊电刺激采精时适宜电压为5~7 V,电刺激结合按摩可以有效缩短射精时间,但不宜短时间内连续采精,因此电刺激法可以在西藏色瓦绵羊人工授精时推广应用。

绵羊精子提取物对卵母细胞的孤雌激活作用

研究了绵羊精子提取物对绵羊卵母细胞的孤雌激活作用，确定了绵羊精子提取物的最佳注射剂量，并将其孤雌激活效果与离子霉素联合6-DMAP法的激活效果进行了比较。结果表明，绵羊精子提取物对绵羊卵母细胞有孤雌激活作用，最佳注射剂量为每个绵羊卵母细胞注入2～4pL浓度5～6mg／mL的绵羊精子提取物；绵羊精子提取物的孤雌激活效果与离子霉素联合6-DMAP法的激活效果差异不显著。

绵羊精子冻融前后差异蛋白质组学研究

【目的】检测和分析绵羊精子冻融前后的差异蛋白质。【方法】用二维凝胶电泳分离精子蛋白,凝胶用考马斯亮蓝染色,用PDQuest8.0软件检测分析差异蛋白质斑点并经液相色谱串联离子阱质谱鉴定。【结果】鲜冻精凝胶图谱分析后得到14个差异蛋白斑点,在国际生物信息学中心数据库搜索到相对应的5种蛋白质:推定的热休克蛋白70.1、转录因子AP-2α蛋白、烯醇酶、烯醇酶1和血清白蛋白前体。在解冻精子中,推定的热休克蛋白70.1、烯醇酶和烯醇酶1含量减少,转录因子AP-2α蛋白含量增加,血清白蛋白前体来源于精浆。【结论】绵羊精子经冷冻、解冻后,蛋白质存在差异,对差异蛋白质的研究有利于探索绵羊精子在冷冻过程中的生理状态,为进一步研究绵羊精子蛋白质组学及揭示精子冻伤机理提供依据。

绵羊胞内单精子注射技术

本文的主要目标是建立绵羊胞内单精子注射技术(intracyioplasmic sperm injection,ICSI)。并且尝试了ICSI技术生产绵羊转基因胚胎的可能性。实验1比较了绵羊卵母细胞孤雌激活的3种化学方法。结果显示,Ionomvcin/3 h/6-dimethylaminopurine(6-DMAP)和Ionomycin激活胚的卵裂率(71.7%和91.8%)和囊胚率(17.4%和11%)显著(P<0.01)高于Ca^(2+)激活胚(18.4%和0)。Ionomycin/3 h/6-DMAP激活胚的囊胚发育形态和比例相对较高。实验2中,活精子注射至卵母细胞质后,用Ionomycin/3 h/6-DMAP激活,排出第二极体(PB2)的71枚ICSI胚胎用SOFaaBSA溶液培养,卵裂率为71.8%(51/71),显著(P<0.01)高于体外受精(41.4%,IVF)和阴性对照胚胎(30.2%,sham-ICSI)。培养7天后,sham-ICSI组没有囊胚生成;ICSI和IVF胚胎的囊胚率分别为7.0%(5/71)和16.1%(9/56),两者差异不显著(P>0.05)。这些ICSI囊胚在冷冻前后均能孵化,显示初步建立了绵羊ICSI技术。另外,我们探索了ICSI技术生产转基因胚胎的可能性,-20℃冻融1次的死精子与pEGFP-N1质粒共注射,33枚2-细胞期ICSI胚胎中,2枚可见GFP蛋白。其中1枚停止发育,另外1枚继续发育至16-细胞期,仍然可见GFP基因的表达。4枚解冻的ICSI囊胚手术移植给2只发情同期化受体绵羊,60天时,B超未见怀孕。本文初步结果表明,ICSI技术生产转基因绵羊有可能性,需深入研究。

两种剂量重离子辐照绵羊精子差异蛋白质组学研究

为检测和分析0.5和3.0Gy 2种剂量重离子辐照绵羊精子差异表达的蛋白质,用二维凝胶电泳分离精子蛋白,凝胶用硝酸银染色,PDQuest8.0检测分析差异表达蛋白斑点并经高效液相色谱串联离子阱质谱鉴定,结果显示:2种剂量凝胶图谱分析后得到8个共同差异蛋白斑点,鉴定为3种表达上调的蛋白质(谷氧还蛋白1、转录因子AP-2α蛋白和烯醇酶)。研究表明:绵羊精子经不同剂量重离子辐照后蛋白质的表达存在差异,对差异表达蛋白质的研究有利于探索绵羊精子在重离子辐照过程中的生理状态,可为进一步研究重离子辐照绵羊精子蛋白质组学奠定基础。

发情羊血清、肝素对绵羊卵母细胞体外受精的影响

绵羊卵母细胞体外成熟后 ,在含 5 %、10 %和 2 0 %发情羊血清的受精液中进行体外受精 ,其分裂率分别是 73 79%、73 2 5 %和 77 61%,显著高于不含发情羊血清的受精液 (0 %,P <0 0 1)。用含 5 %发情羊血清的受精液为基础液 ,添加 5u/ml和 10u/ml的肝素 ,受精后的分裂率分别为 86 63 %和 75 5 3 %,5u/ml肝素组的分裂率与不加肝素组 (86 64 %)差异不显著 ,而 10u/ml高浓度肝素组的分裂率则显著低于其他两组 (P <0 0 1)。

精子载体法在转基因家畜中的应用与前景

论文综述了精子载体法在家畜(猪、牛、羊)遗传育种、乳腺生物反应器和异种器官移植中的应用,并对其今后发展方向进行了展望。

无角道赛特绵羊精液低温和冷冻保存试验

采用不同成分的稀释液对无角道赛特14号种公羊鲜精进行了低温保存(4℃)和冷冻保存(-196℃)试验。结果表明:在4℃条件下,精液在A、B、C和D四种稀释液中分别保存72h、72h、144h和192h后,仍然满足输精要求,从而确定D液为最佳稀释液(30g/L葡萄糖、14g/L柠檬酸钠、3g/L乙二胺四乙酸钠、2g/LvE、50mL/L卵黄)。在冷冻保存试验中,C液为细管精液冷冻保存最佳稀释液(56g/L蔗糖、52g/L乳糖、4g/L乙二胺四乙酸钠、2g/LvE、50mL/L甘油、50mL/L卵黄),冻后精液的活力为0.48;在上述实验基础上,给C液中分别添加催产素(添加后浓度为20IU/100mL)、前列腺素(添加后浓度为0.1mg/100mL)及催产素+前列腺素(20IU/100mL+0.1mg/100mL)进行细管精液冷冻保存,其冻后活力分别为0.55、0.48、0.52,说明含20IU/100mLOT的C液对无角道赛特绵羊精液的冷冻保存效果最好。

精子提取物对绵羊显微授精受精率及胚胎发育影响的研究

将绵羊精子可溶性提取物与单个不运动绵羊精子共同注射于体外成熟的绵羊卵母细胞（显微授精）并在体外培养。结果发现，共同注射的卵母细胞卵裂率、２～１６细胞发育率、桑椹胚发育率、囊胚发育率均显著高于对照组，其中卵母细胞卵裂率和２～１６细胞发育率还显著高于精子单独注射组；桑椹胚、囊胚发育率明显高于精子单独注射组。对该组囊胚的免疫荧光染色分析表明，内细胞团数量与体外受精组相似，说明提取物对精子注射的受精卵或胚胎具有明显的促进发育作用。