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Cloning and Expression of One Fibrinolytic Enzyme from Bacillus sp. zlw-2 被引量:6
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作者 HAN Xin-mian GUO Run-fang YU Hong-wei JIA Ying-min 《Agricultural Sciences in China》 CAS CSCD 2009年第5期591-596,共6页
The gene encoding fibrinolytic enzyme from Bacillus sp. zlw-2 was cloned and sequenced (accession no. EU734749), which was 1146 bp, encoded 381 amino acids and had 99% homology with Nattokinase YF308 and NAT. The ge... The gene encoding fibrinolytic enzyme from Bacillus sp. zlw-2 was cloned and sequenced (accession no. EU734749), which was 1146 bp, encoded 381 amino acids and had 99% homology with Nattokinase YF308 and NAT. The genes encoding pre-pro-fibrinolytic enzyme (including signal peptide, propeptide, and mature peptide) and fibrinolytic enzyme (including mature peptide) were cloned into pET28a vector respectively and then transformed into Escherichia coli BL21 (DE3). The recombinant ofpre-pro-fibrinolytic enzyme showed enzyme activity of 183 U mL^-1, while no detectable enzyme activity could be found from the recombinant of the mature peptide. 展开更多
关键词 fibrinolytic enzyme NATTOKINASE CLONE recombinant expression
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蚯蚓纤溶酶新基因PV_(242)的克隆与表达 被引量:19
2
作者 徐义辉 梁国栋 +4 位作者 孙兆军 陈飞 付士红 柴玉波 侯云德 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2002年第4期610-614,共5页
从我国特有的双胸蚓属 (Lumbricusbimastus)蚯蚓体内提取到一种有纤维蛋白平板溶解活性的蛋白质 ,采用聚偏二氟乙烯膜 (PVDF)微量测序法测得蛋白质的N端氨基酸序列 ,依此设计简并引物 ,通过RT PCR获得其对应cDNA .该cDNA全长 888bp ,1~... 从我国特有的双胸蚓属 (Lumbricusbimastus)蚯蚓体内提取到一种有纤维蛋白平板溶解活性的蛋白质 ,采用聚偏二氟乙烯膜 (PVDF)微量测序法测得蛋白质的N端氨基酸序列 ,依此设计简并引物 ,通过RT PCR获得其对应cDNA .该cDNA全长 888bp ,1~ 72 6位核苷酸对应读码框架 (ORF) ,编码含 2 4 2个氨基酸的成熟肽 .终止子 (TAG)位于cDNA的 72 7~ 72 9位 ,其余核苷酸序列为 3′端非编码区 .成熟肽命名为蚯蚓纤溶酶PV2 42 .蛋白质预测得知蛋白质等电点为 4 33,含组氨酸 (His4 4 )及丝氨酸 (Ser191)两个活性位点 ;蛋白质由两个结构域组成 ,表面有活性裂隙 ;该蛋白质属丝氨酸蛋白酶超家族胰蛋白酶类 .经国际基因库等多种查询比较未见PV2 42 基因的报道 ,为首次发现的新基因 ,在国际基因库的输入号为GenBankAF10 96 4 8.随后构建了pTrxFUS PV2 42 重组质粒 ,并在大肠杆菌GI72 4中获得融合蛋白TrxA/PV2 42 的可溶性表达 ,采用离子交换层析法纯化表达蛋白 ,融合蛋白有纤维平板溶解活性 . 展开更多
关键词 蚯蚓纤溶酶 新基因 PV242 克隆 表达 双胸蚓属 蛋白质测序
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蚯蚓纤溶酶在大肠杆菌中的克隆与表达 被引量:12
3
作者 赵晓瑜 静天玉 +2 位作者 王彦芳 王会文 李亚东 《河北大学学报(自然科学版)》 CAS 2002年第4期392-395,共4页
根据蚯蚓纤溶酶最佳组分的N -末端氨基酸序列设计简并引物 ,以蚯蚓cDNA为模板 ,获得该组分蛋白质的部分编码序列 (AF4 32 2 2 4 ,GenBank登陆号 ) .BLAST相似性分析表明 ,该序列与U 2 5 6 43和U2 5 6 48的部分序列相似性达 91% ,根据 5... 根据蚯蚓纤溶酶最佳组分的N -末端氨基酸序列设计简并引物 ,以蚯蚓cDNA为模板 ,获得该组分蛋白质的部分编码序列 (AF4 32 2 2 4 ,GenBank登陆号 ) .BLAST相似性分析表明 ,该序列与U 2 5 6 43和U2 5 6 48的部分序列相似性达 91% ,根据 5’和 3’末端保守序列设计引物 ,经PCR获得全长cDNA编码序列 .将该序列插入 pTBY - 11质粒 ,转化大肠杆菌 ,表达蛋白以包含体形式存在 . 展开更多
关键词 蚯蚓纤溶酶 分子克隆 基因表达 大肠杆菌 编码序列 基因克隆 表达载体
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解淀粉芽孢杆菌DC-4豆豉溶栓酶成熟肽编码序列的克隆及表达 被引量:25
4
作者 彭勇 张义正 《应用与环境生物学报》 CAS CSCD 2002年第3期285-289,共5页
利用PCR方法从解淀粉芽孢杆菌DC 4总DNA中扩增出豆豉溶栓酶 (DFE)成熟肽编码区片段 .测序结果表明 :DFE成熟肽编码区长 82 5bp,编码 2 75个氨基酸残基 ,分子量为 2 7.7× 10 3 ,推导的N’ -端氨基酸序列与豆豉溶栓酶N’ -端氨基酸... 利用PCR方法从解淀粉芽孢杆菌DC 4总DNA中扩增出豆豉溶栓酶 (DFE)成熟肽编码区片段 .测序结果表明 :DFE成熟肽编码区长 82 5bp,编码 2 75个氨基酸残基 ,分子量为 2 7.7× 10 3 ,推导的N’ -端氨基酸序列与豆豉溶栓酶N’ -端氨基酸测序结果完全一致 ,说明克隆到的基因确实是豆豉溶栓酶基因 .同源性分析表明 ,DFE成熟肽编码区的核苷酸和氨基酸序列与日本纳豆激酶的同源性分别为 80 .0 %和 86 .5 % ,这提示豆豉溶栓酶可能是一种新型的溶栓酶 .将表达质粒pET Nde转化E .coliBL2 1(DE3)中 ,IPTG可诱导表达大量的DFE融合蛋白 ,占菌体可溶性蛋白的 4 0 % ,主要以包涵体的形式存在 .图 3表 1参 展开更多
关键词 解淀粉芽孢杆菌DC-4 豆鼓 溶栓酶 成熟肽 编码序列 克隆 表达
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枯草杆菌纤溶酶基因的克隆及表达 被引量:8
5
作者 罗文华 郭勇 韩双艳 《华南理工大学学报(自然科学版)》 EI CAS CSCD 北大核心 2007年第11期115-119,共5页
为了提高豆豉纤溶酶(DFE)的表达产量,采用PCR方法从高纤溶活性的枯草芽孢杆菌DC12的基因组中扩增获得DFE基因,将含有启动子至3非翻译区的全长1400 bp基因插入大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pBE3,构建了DFE基因的表达质粒,化学转化枯草杆菌WB... 为了提高豆豉纤溶酶(DFE)的表达产量,采用PCR方法从高纤溶活性的枯草芽孢杆菌DC12的基因组中扩增获得DFE基因,将含有启动子至3非翻译区的全长1400 bp基因插入大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pBE3,构建了DFE基因的表达质粒,化学转化枯草杆菌WB800获得了DFE的重组表达菌.试验结果表明:DFE基因在自身启动子驱动下,在蛋白酶缺陷型的枯草杆菌中获得了高活性的分泌表达;重组表达菌株培养30 h后,培养物上清液中的纤溶酶活性最高可达690U/mL. 展开更多
关键词 豆豉纤溶酶 枯草杆菌 基因克隆 表达
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基因重组沙蚕纤溶活性蛋白的克隆、表达和活性检测 被引量:3
6
作者 闫志勇 李荣贵 +4 位作者 赵百慧 宋旭霞 丁守怡 钱冬萌 王斌 《中国药学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第19期1452-1456,共5页
目的从双齿围沙蚕消化道中克隆并表达具有纤维蛋白溶解活性的蛋白。方法提取沙蚕消化道上皮细胞RNA,逆转录获得cDNA。根据丝氨酸蛋白酶家族基因保守序列设计兼并引物,筛选包含丝氨酸蛋白家族保守位点的阳性克隆,进行核苷酸测序。根据该... 目的从双齿围沙蚕消化道中克隆并表达具有纤维蛋白溶解活性的蛋白。方法提取沙蚕消化道上皮细胞RNA,逆转录获得cDNA。根据丝氨酸蛋白酶家族基因保守序列设计兼并引物,筛选包含丝氨酸蛋白家族保守位点的阳性克隆,进行核苷酸测序。根据该序列利用5′RACE技术进行扩增,将获得的基因片段克隆到pMAL-p2载体中,在大肠杆菌BL21中进行融合表达。表达的融合蛋白经过直链淀粉树脂亲和色谱和DEAE-Sepharose 4B纯化后,纤维蛋白平板法检测其溶栓活性。结果cDNA经5′RACE扩增获得长度为260 bp的基因片段,推测其包含可编码83个氨基酸的完整序列(约9.0×103);重组pMAL-p2表达出51.0×103的融合蛋白,经过测定具有明显的溶栓活性。结论从双齿围沙蚕中克隆获得的基因片段表达的融合蛋白具有溶栓活性,有望成为一种新型的纤溶药物。 展开更多
关键词 双齿围沙蚕 纤溶酶 基因克隆 重组表达
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豆豉纤溶酶基因的克隆及其在枯草杆菌中的表达 被引量:4
7
作者 齐海萍 冮洁 +2 位作者 胡文忠 姜爱丽 田密霞 《大豆科学》 CAS CSCD 北大核心 2012年第1期159-161,共3页
以实验室筛选的UD8豆豉芽孢杆菌的总DNA为模板,应用PCR技术根据豆豉纤溶酶基因DNA序列(GeneBank AY720895.2)设计并合成1对引物,扩增出了豆豉纤溶酶基因,将该基因克隆到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒EC-BS8上,构建成表达质粒EC-BS8,再... 以实验室筛选的UD8豆豉芽孢杆菌的总DNA为模板,应用PCR技术根据豆豉纤溶酶基因DNA序列(GeneBank AY720895.2)设计并合成1对引物,扩增出了豆豉纤溶酶基因,将该基因克隆到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒EC-BS8上,构建成表达质粒EC-BS8,再将其转化到枯草芽孢杆菌Bs6中。筛选表达菌株,实现了豆豉纤溶酶基因在枯草杆菌中高效表达。获得重组菌纤溶酶活力高达9 830 IU.mL-1,是出发菌株活力的2.9倍。经纯化SDS-PAGE鉴定重组豆豉纤溶酶相对分子质量为31.0 kDa。 展开更多
关键词 豆豉纤溶酶 基因克隆 高效表达 枯草芽孢杆菌
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豆豉纤溶酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达 被引量:5
8
作者 吕美云 张新 陆云华 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2008年第6期2270-2271,共2页
[目的]为豆豉纤溶酶的进一步研究与应用奠定基础。[方法]以从芽孢杆菌中提取的总DNA为模板,根据GenBank的豆豉纤溶酶基因(AY720895.2)DNA序列设计1对引物,克隆豆豉纤溶酶基因并进行序列测定。构建毕赤酵母表达载体pL3,在毕赤酵母中表达... [目的]为豆豉纤溶酶的进一步研究与应用奠定基础。[方法]以从芽孢杆菌中提取的总DNA为模板,根据GenBank的豆豉纤溶酶基因(AY720895.2)DNA序列设计1对引物,克隆豆豉纤溶酶基因并进行序列测定。构建毕赤酵母表达载体pL3,在毕赤酵母中表达豆豉纤溶酶基因。[结果]经PCR扩增可获得约1.1 kb的DNA片段。序列分析表明所克隆DNA片段包含1个1089 bp的开放阅读框,编码363个氨基酸。该克隆基因与所发表的豆豉纤溶酶基因序列的核苷酸序列同源性为98%,而氨基酸序列同源性达100%。[结论]所克隆的豆豉溶纤酶基因在毕赤酵母中成功表达,且表达产物具有正常的生物学活性。 展开更多
关键词 豆豉纤溶酶 基因克隆 表达 毕赤酵母
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蚯蚓纤溶酶基因(Efp-Ⅰ)在大肠杆菌中的克隆、表达及活性分析 被引量:1
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作者 赵晓瑜 李晓霞 +1 位作者 侯艳 静天玉 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第3期452-456,共5页
从GenBank查询到的蚯蚓纤溶酶(earthworm fibrinolyti cenzyme,EFE)基因序列中,只有AY438624翻译的蛋白质序列与天然EfP-Ⅰ在N-端具有较高的相似性。根据该基因的5′与3′序列设计引物,通过RT-PCR从赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)获得一个... 从GenBank查询到的蚯蚓纤溶酶(earthworm fibrinolyti cenzyme,EFE)基因序列中,只有AY438624翻译的蛋白质序列与天然EfP-Ⅰ在N-端具有较高的相似性。根据该基因的5′与3′序列设计引物,通过RT-PCR从赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)获得一个完整的基因(GenBank,DQ418454)。序列分析证明,由该基因编码蛋白质的N-末端与天然EfP-Ⅰ的N-末端的氨基酸顺序完全相同。ScanProsite prediction programs分析显示,该基因与AY438624相似性极高,二者均属于胰蛋白酶家族;不同的是,该基因编码蛋白质的序列中含有N-糖苷键的结构域,所以DQ418454是EfP-Ⅰ中的一个新基因。在此基础上,构建了该基因的原核表达载体pMAL-c2X-Efp-Ⅰ,并进行了转化、诱导和表达。Western blotting证明,表达产物同时具有MBP和EfP-Ⅰ的抗原特异性,是MBP和EfP-Ⅰ的融合蛋白(MBP-EfP-Ⅰ)。经亲和层析分离纯化的MBP-EfP-Ⅰ,在酪蛋白平板和纤维蛋白平板上表现出明显的纤溶酶活性。 展开更多
关键词 赤子爱胜蚓 蚯蚓纤溶酶 基因克隆 融合表达 纤溶酶活性
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Bacillus sp.nov SK006中纤维蛋白溶解酶的克隆及其在大肠杆菌中的表达
10
作者 秦芸桦 沐万孟 江波 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2011年第9期22-24,共3页
利用PCR技术从Bacillus sp.nov SK006中扩增得到纤维蛋白溶解酶(Fibrinolitic enzymes,FE)基因的DNA片段,将其连接到pMD-T载体上,经测序后克隆至载体PET-22b(+),转化至E.coli BL21(DE3)中,得到的重组菌能高效表达FE。诱导表达后,SDS-PAG... 利用PCR技术从Bacillus sp.nov SK006中扩增得到纤维蛋白溶解酶(Fibrinolitic enzymes,FE)基因的DNA片段,将其连接到pMD-T载体上,经测序后克隆至载体PET-22b(+),转化至E.coli BL21(DE3)中,得到的重组菌能高效表达FE。诱导表达后,SDS-PAGE显示,重组FE分子量约为28 ku。 展开更多
关键词 虾酱 纤维蛋白溶解酶 克隆 表达
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岩栖蝮蛇毒纤溶酶基因克隆、序列分析及真核表达载体的构建与鉴定
11
作者 于德涵 赵文阁 +1 位作者 王广慧 李贺 《中国农学通报》 CSCD 北大核心 2011年第14期17-21,共5页
克隆岩栖蝮蛇(Gloydius saxatilis)纤维溶解酶(Fibrinolytic enzyme,FLE)基因,分析基因序列并对该基因的功能进行分析;构建真核表达载体并鉴定。从岩栖蝮蛇毒腺细胞中提取总RNA,通过RT-PCR法扩增纤溶酶基因,与pMD18-T载体连接进行TA克隆... 克隆岩栖蝮蛇(Gloydius saxatilis)纤维溶解酶(Fibrinolytic enzyme,FLE)基因,分析基因序列并对该基因的功能进行分析;构建真核表达载体并鉴定。从岩栖蝮蛇毒腺细胞中提取总RNA,通过RT-PCR法扩增纤溶酶基因,与pMD18-T载体连接进行TA克隆,再进行序列的测定并且对该序列进行分析。测序鉴定后将纤溶酶基因克隆入真核表达载体pEGFP-C1,构建该基因的真核表达载体pEGFP-FLE,进行双酶切、PCR和测序鉴定。扩增得到包括完整开放读码框在内的长为774bp的纤溶酶基因序列,成功克隆了编码岩栖蝮蛇纤溶酶的基因序列,开放读码框编码257个氨基酸,其分子质量约为30kDa,成功构建了真核表达载体pEGFP-FLE。成功克隆岩栖蝮蛇毒纤溶酶基因并构建该酶的真核表达载体为该基因的真核表达及后续研究提供依据。 展开更多
关键词 岩栖蝮蛇 纤溶酶 基因克隆 序列分析 真核表达载体
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微生物源纤溶酶基因的克隆及表达研究进展 被引量:2
12
作者 赵易宇 刘晓兰 +2 位作者 邓永平 江成英 郑喜群 《齐齐哈尔大学学报(自然科学版)》 2016年第6期67-71,共5页
血栓栓塞性疾病严重危害人类生命和健康,溶栓疗法效果显著。在新型溶栓制剂的研究中,微生物来源的纤溶酶研究引起越来越多的关注。通过分子生物学手段构建重组纤溶酶,实现酶的高效表达已经成为研究热点,本文对微生物来源的纤溶酶基因克... 血栓栓塞性疾病严重危害人类生命和健康,溶栓疗法效果显著。在新型溶栓制剂的研究中,微生物来源的纤溶酶研究引起越来越多的关注。通过分子生物学手段构建重组纤溶酶,实现酶的高效表达已经成为研究热点,本文对微生物来源的纤溶酶基因克隆与表达的研究现状进行了综述。 展开更多
关键词 微生物 纤溶酶 基因克隆 表达 基因工程
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高活性纤溶酶菌株筛选与基因克隆表达 被引量:2
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作者 王志会 谢和 《山地农业生物学报》 2019年第2期1-7,共7页
本研究以本实验室曾在酒曲、酒糟、窖泥等样品中分离的具有酱香味的13株菌株作为出发菌株,经脱脂奶粉平板、纤维蛋白双层平板筛选出纤溶酶活性最高的菌株GZHZ V-8 ,结合形态学特征、生理生化特征及16S rDNA序列同源性分析,GZHZ V-8 菌... 本研究以本实验室曾在酒曲、酒糟、窖泥等样品中分离的具有酱香味的13株菌株作为出发菌株,经脱脂奶粉平板、纤维蛋白双层平板筛选出纤溶酶活性最高的菌株GZHZ V-8 ,结合形态学特征、生理生化特征及16S rDNA序列同源性分析,GZHZ V-8 菌株为解淀粉芽孢杆菌( Bacillus amyloliquefaciens )。以GZHZ V-8 菌株总DNA为模板扩增出纤溶酶基因的编码区,与pMD18-T载体连接、转化至大肠杆菌( Escherichia coli ) DH5α,分析表明纤溶酶基因开放阅读框包含1092 bp碱基,编码363个氨基酸。纤溶酶基因与表达载体pET-22b(+)连接转化至 E.coli BL21中表达,表达菌株经IPTG诱导表达分泌活性纤溶酶,培养后测得发酵上清液、菌体细胞破碎上清液和菌体细胞破碎沉淀的纤溶酶活力分别为613.26 IU/mL、407.38 IU/mL、993.12 IU/mL。 展开更多
关键词 纤溶酶 基因克隆 序列分析 表达
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假蕈状芽孢杆菌纤溶酶基因的克隆与表达 被引量:3
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作者 郭晓军 袁洪水 +2 位作者 刘慧娟 张冬冬 朱宝成 《中国医药工业杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期14-16,65,共4页
将来自假蕈状芽孢杆菌的纤溶酶基因克隆至表达载体pGEX-4T-2中,并在大肠杆菌中表达。SDS—PAGE结果显示胞内含有表达条带,表达产物的相对分子量大小为9.8×10^4,比预计的分子量(90×10^4)稍大,酪蛋白平板法测定结果显示... 将来自假蕈状芽孢杆菌的纤溶酶基因克隆至表达载体pGEX-4T-2中,并在大肠杆菌中表达。SDS—PAGE结果显示胞内含有表达条带,表达产物的相对分子量大小为9.8×10^4,比预计的分子量(90×10^4)稍大,酪蛋白平板法测定结果显示,以1.0mmol/L IPTG26℃和30℃诱导5h,重组细胞内蛋白有活性。 展开更多
关键词 纤溶酶 假蕈状芽孢杆菌 克隆 表达
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内生多粘类芽胞杆菌纤溶酶基因PPFE-I在大肠杆菌中融合表达及活性分析 被引量:2
15
作者 吕凤霞 陆兆新 +5 位作者 别小妹 林谦 张充 曹林 郭瑶 汤彦翀 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第8期1128-1134,共7页
以内生多粘类芽胞杆菌EJS-3基因组DNA为模板,PCR扩增PPFE-I基因,并克隆到pMD19-T载体上,构建克隆载体pMD-PPFE-I,经测序正确后,将PPFE-I基因克隆至表达载体pET-DsbA上构建重组表达质粒pET-DsbA/PPFE-I,将其转化至E.coli BL21(DE3),在IPT... 以内生多粘类芽胞杆菌EJS-3基因组DNA为模板,PCR扩增PPFE-I基因,并克隆到pMD19-T载体上,构建克隆载体pMD-PPFE-I,经测序正确后,将PPFE-I基因克隆至表达载体pET-DsbA上构建重组表达质粒pET-DsbA/PPFE-I,将其转化至E.coli BL21(DE3),在IPTG诱导下实现了融合蛋白DsbA-PPFE-I的表达,表达产物酶活性达228IU/mL。表达产物用SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定。SDS-PAGE电泳检测表明融合蛋白主要以可溶形式表达,占菌体总蛋白的18.4%。Western blotting结果表明在相应分子量处有一条特异性条带,证实该蛋白为DsbA-PPFE-I融合蛋白。表达产物通过Ni亲和柱、凝血酶酶切及Sephadex G-100等步骤进行分离纯化,并用MALDI-TOF质谱对重组酶进行了鉴定。纯化后的表达产物在纤维蛋白平板上表现出明显的纤溶活性。 展开更多
关键词 内生菌 多粘类芽胞杆菌 纤溶酶 基因克隆 融合表达
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土鳖虫纤溶酶编码区序列的克隆与表达
16
作者 李兴暖 何巍 +2 位作者 周裔春 黄宇峰 韩雅莉 《中国中药杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第15期1925-1930,共6页
目的:获得土鳖虫纤溶酶编码区序列,并进行原核和真核表达。方法:根据已报道的多种动物纤溶酶基因cDNA序列设计引物,用RT-PCR和3′RACE法克隆得到土鳖虫纤溶酶编码区序列;将该序列克隆进入大肠杆菌和毕赤酵母进行表达。结果:序列分析表明... 目的:获得土鳖虫纤溶酶编码区序列,并进行原核和真核表达。方法:根据已报道的多种动物纤溶酶基因cDNA序列设计引物,用RT-PCR和3′RACE法克隆得到土鳖虫纤溶酶编码区序列;将该序列克隆进入大肠杆菌和毕赤酵母进行表达。结果:序列分析表明,所克隆的纤溶酶编码区序列长672bp,共编码224个氨基酸残基,起始氨基酸序列为IVGG,与多种动物纤溶酶一致。将此cDNA序列在大肠杆菌和毕赤酵母中进行表达,前者获得没有活性的表达蛋白,后者获得具有纤溶活性的重组表达蛋白。结论:首次报道了土鳖虫纤溶酶编码区序列,并进行了初步表达,为进一步研究其功能奠定了基础。 展开更多
关键词 土鳖虫 纤溶酶基因 克隆 表达
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