ABCE1基因siRNA表达质粒的构建及鉴定

目的:构建针对人ABCE1基因siRNA表达质粒,为进一步研究该基因功能奠定基础。方法:合成含靶向ABCE1基因siRNA转录模板的茎环结构,与两端分别有BamHⅠ、HindⅢ酶切位点的RNAi-Ready pSIREN-DNR-DsRed-Express质粒连接,大肠杆菌中扩增,测序鉴定。结果:转化大肠杆菌涂布平板长出阳性菌落,重组质粒电泳初步说明质粒构建成功,测序结果表明RNAi-Ready pSIREN-DNR-DsRed-Express的酶切位点BamHⅠ、HindⅢ之间有71bp的插入片段,其序列与所设计、合成的ABCE1的siRNA转录模板序列一致。结论:siRNA转录模板完整正确地插入RNAi-Ready pSIREN-DNR-DsRed-Express质粒中。

C-erbB2基因siRNA质粒的构建、鉴定及转染

目的构建人C-erbB2干扰载体pGenesil-erbB2,并稳定转染入CerbB-2高表达的人结肠癌细胞株HT-29细胞,观察其对人结肠癌HT-29细胞从转录后水平对Her-2蛋白表达的影响。方法利用免疫组化方法筛选出CerbB-2高表达细胞株HT-29,以人C-erbB2cDNA基因为靶标设计RNA干扰片段和阴性对照片段,退火形成双链并克隆进入载体pGenesil-erbB,进行鉴定及测序,并稳定转染至HT-29细胞。结果测序证明人C-erbB2siRNA表达载体质粒pGenesil-erbB构建成功,pGenesil-erbB稳定转染入人结肠癌HT-29细胞,采用Westernblot实验证明pGenesil-erbB可显著抑制Her-2蛋白的表达。结论成功构建了人CerbB2干扰载体质粒pGenesil-erbB,稳定转染至结肠癌HT-29细胞株,并能抑制HT-29细胞的Her-2蛋白的表达,为靶向CerbB2的siRNA对结肠癌的放射增敏研究奠定了基础。

ABCE1基因siRNA表达质粒的构建及在95-D肺腺癌细胞中的表达

目的构建针对人ABCE1基因siRNA表达质粒,为进一步研究该基因功能奠定基础。方法合成含靶向ABCE1基因siRNA转录模板的茎环结构,与两端分别有BamHⅠ、HindⅢ酶切位点的RNAi-ReadypSIREN-DNR-DsRed-Express质粒连接,大肠杆菌中扩增,测序鉴定,转染到95-D肺腺癌细胞中,观察其表达。结果转化大肠杆菌涂布平板长出阳性菌落,重组质粒电泳初步说明质粒构建成功,测序结果表明RNAi-ReadypSIREN-DNR-DsRed-Express的酶切位点BamHⅠ、HindⅢ之间有71bp的插入片段,其序列与所设计、合成的ABCE1的siRNA转录模板序列一致,该质粒转染到95-D细胞中表达为红色荧光蛋白。结论 siRNA转录模板完整正确地插入RNAi-Ready pSIREN-DNR-DsRed-Express质粒中。

PTHrP基因靶向RNA干扰重组表达质粒的构建鉴定以及在HTB-94细胞中的功能检测

目的构建针对目的基因PTHrp的pSilencer3.1-H1neo siRNA(small interfering RNA)表达质粒,并在人体软骨肉瘤细胞HTB-94中观察其干扰效果。方法设计并合成针对PTHrP基因编码区的含有发卡结构的互补的寡核苷酸链,体外退火后克隆入经BamHⅠ,HindⅢ双酶切线性化的干扰载体pSilencerTM3.1H1neo中,对重组质粒进行酶切分析和DNA系列测定。结果双酶切证实PTHrP siRNA表达质粒克隆构建成功,插入片段测序结果与合成的siRNA结果一致,同时干扰了PTHrP基因的mRNA和蛋白的表达。结论成功构建的靶向RNA干扰重组表达质粒,可以通过小RNA序列干扰靶向基因的mRNA转录,降低靶向基因在细胞中mRNA和蛋白的表达。

人TGF-β_2特异性siRNA质粒的构建

目的:构建人TGF-β2特异性siRNA质粒。方法:从NCBI中查找人TGF-β2的mRNA序列,并利用生物信息学对序列进行分析;根据siRNA的设计原则,选择最佳的siRNA序列;利用限制性内切酶BamHⅠ和BbsⅠ将相应的双链DNA插入到GPU6/GFP/Neo载体中;重组质粒经限制性内切酶BamHⅠ和PstⅠ单酶切进行鉴定,鉴定正确的质粒进一步通过基因测序的方法进行验证。结果:根据生物信息学选择TGF-β2mRNA的1016～1034区域作为干扰位点;重组质粒酶切结果表明双链DNA序列成功插入到了GPU6/GFP/Neo载体中;测序分析结果进一步证明插入序列与设计完全一致。结论:成功构建了人TGF-β2特异性siRNA干扰质粒,为研究TGF-β2基因功能和利用基因治疗的方法提高青光眼滤过手术成功率奠定了实验基础。

c-myc靶向siRNA真核表达载体的构建和鉴定

目的:设计构建重组体为转染肿瘤细胞,观察癌基因的沉默效果,为探索肿瘤基因治疗的新途径打好基础。方法:以c-myc为靶基因,以pEGFP-C1/U6质粒为载体,设计构建重组体,根据c-myc癌基因cDNA序列,设计有小发夹结构的3条寡核苷酸序列,克隆到空载体pEGFP-C1/U6中,转化DH5а菌株,提取质粒,进行酶切鉴定和测序分析。结果:经酶切鉴定筛出的重组体测序结果与目的序列相同,重组载体构建成功。结论:利用RNAi技术可成功构建小干扰RNA重组体。

靶向性血小板衍生生长因子siRNA表达质粒的构建及鉴定

目的 构建靶向性血小板衍生生长因子(PDGF)B链的小分子干扰RNA(siRNA)表达质粒,为进一步研究PDGF基因功能奠定基础.方法 根据PDGF-B链序列设计合成含靶向PDGF基因siRNA转录模板的茎环结构,与两端分别有Bam HI、HindIII酶切位点的pSilencer3.1-Hlhygro质粒连接,转化大肠杆菌,扩增、纯化得到所需质粒,通过琼脂糖凝胶电泳及基因测序鉴定其分子量及插入片段的序列.结果 PCR扩增片段与预期结果相符,双酶切证实PDGF siRNA表达载体克隆构建成功,插入片段测序结果与合成的siRNA结果一致.结论 成功构建了靶向性PDGF基因的siRNAs表达质粒.