人TGF-β_2特异性siRNA质粒的构建

目的:构建人TGF-β2特异性siRNA质粒。方法:从NCBI中查找人TGF-β2的mRNA序列,并利用生物信息学对序列进行分析;根据siRNA的设计原则,选择最佳的siRNA序列;利用限制性内切酶BamHⅠ和BbsⅠ将相应的双链DNA插入到GPU6/GFP/Neo载体中;重组质粒经限制性内切酶BamHⅠ和PstⅠ单酶切进行鉴定,鉴定正确的质粒进一步通过基因测序的方法进行验证。结果:根据生物信息学选择TGF-β2mRNA的1016～1034区域作为干扰位点;重组质粒酶切结果表明双链DNA序列成功插入到了GPU6/GFP/Neo载体中;测序分析结果进一步证明插入序列与设计完全一致。结论:成功构建了人TGF-β2特异性siRNA干扰质粒,为研究TGF-β2基因功能和利用基因治疗的方法提高青光眼滤过手术成功率奠定了实验基础。

绵羊ApoER2基因克隆及其干扰质粒对睾丸共培养细胞硒蛋白表达的影响

本研究旨在克隆绵羊ApoER2基因,构建ApoER2-siRNA质粒载体,研究ApoER2基因沉默对睾丸共培养细胞SelP和PHGPx表达的影响。利用RT-PCR技术,克隆ApoER2序列,在此基础上构建4种pGPU6/GFP/Neo—ApoER2-siRNA质粒表达载体,利用脂质体将其转染到体外共培养绵羊睾丸细胞中,采用Real—time PCR和Western blotting方法,检测其抑制效应,并研究ApoER2基因沉默对Sel P和PHGPx mRNA表达的影响。本研究成功获得了长度为2 490 bp的绵羊睾丸ApoER2完整编码区序列,共编码892个氨基酸,绵羊ApoER2核苷酸序列与牛的同源性最高,相似性为97.7%。ApoER2-siRNA-1565和ApoER2-siRNA-2567位点重组质粒的干扰效果较好(P<0.01),选取ApoER2-siRNA-2567重组质粒,结果显示转染组Sel P和PHGPx表达量显著降低(P<0.01)。获得了绵羊ApoER2编码区序列和有效抑制该基因表达的2个质粒载体,ApoER2沉默可能影响了睾丸硒蛋白Sel P和PHGPx的表达,为进一步研究ApoER2转运硒机理提供了理论依据。

成釉细胞瘤中MMP-2的表达及RNA干扰的抑制作用

目的:研究MMP-2在成釉细胞瘤中的表达和RNA干扰对成釉细胞瘤细胞中MMP-2基因的沉默效应。方法:培养成釉细胞瘤细胞,应用免疫组织化学方法检测成釉细胞瘤中MMP-2的表达;体外构建MMP-2靶向siRNA质粒表达载体,将siRNA质粒表达载体转染原代培养的成釉细胞瘤细胞,激光共聚焦显微镜检测siRNA质粒表达载体的转染效率,RT-PCR检测成釉细胞瘤细胞中MMP-2mRNA的改变,明胶酶谱法检测MMP-2的变化,应用SPSS11.0统计软件中的t检验对结果进行统计学分析。结果:成釉细胞瘤中MMP-2呈阳性表达,siRNA质粒表达载体对原代培养的成釉细胞瘤细胞的转染率为41.8%;转染后,成釉细胞瘤细胞的MMP-2mRNA表达水平显著降低,酶原性MMP-2和活性MMP-2显著减少,P<0.05。结论:体外构建的MMP-2靶向siRNA质粒表达载体可以转染体外培养的成釉细胞瘤细胞,并导致MMP-2基因沉默。

ER-β基因RNA干扰重组表达载体的构建及鉴定

目的:构建针对人雌激素受体-β(estrogen receptor-β,ER-β)基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)真核表达载体质粒。方法:根据GeneBank数据库提供的ER-β基因核苷酸序列,选择设计能转录小发卡结构RNA的DNA序列,将此双链DNA片段克隆至载体pSilencer3.1-H1-neo中构建重组表达载体,转化DH5α菌株,提取质粒进行序列测定。结果:经测序证明与设计的相同,获得人ER-β基因的siRNA表达载体质粒。结论:成功构建了针对ER-β基因的RNA干扰重组表达载体,为下一步ER-β基因的RNA干扰奠定了基础。