siRNA干扰IRX2对骨肉瘤细胞增殖的影响及其机制

目的探讨易洛魁族同源盒2(iroquois homebox 2,IRX2)基因在骨肉瘤细胞中的表达及其对细胞增殖和细胞周期的影响。方法体外培养骨肉瘤细胞系,应用RT-PCR和Western blot检测各细胞系中IRX2表达;IRX2-siRNA干扰IRX2的表达后,分别用MTT和流式细胞仪检测MG-63细胞的增殖和周期;Western blot检测JAK3和STAT5活化水平。结果 IRX2在骨肉瘤细胞系中的表达显著高于人成骨细胞系(P<0.05);沉默IRX2的表达可显著抑制骨肉瘤细胞系MG-63的增殖,促使其S期细胞比例[(23.93±1.92)%]较对照组[(15.84±1.76)%]增加(P<0.05),而G2/M期细胞比例[(10.44±1.99)%]较对照组[(23.14±3.19)%]降低(P<0.05)。IRX2-siRNA可下调p-JAK3和p-STAT5水平(P<0.05),而过表达IRX2可上调p-JAK3和p-STAT5水平,并促进MG-63细胞增殖(P<0.05)。在JAK3和STAT5抑制剂的作用下,过表达IRX2对MG-63细胞的促增殖作用显著减弱。结论 IRX2可部分通过JAK3/STAT5信号通路调控骨肉瘤细胞的增殖。

siRNA干扰相互作用蛋白1表达抑制胶质瘤细胞的侵袭和迁移

目的探讨小干扰RNA(si RNA)干扰降低PC4和SFRS1相互作用蛋白1(PSIP1)的表达对人胶质瘤U87细胞侵袭和迁移的影响并初步探讨其机制。方法采用化学合成靶向PSIP1的si RNA,脂质体法转染U87细胞,用Real-time PCR检测RNA干扰效率;Transwell侵袭实验测细胞侵袭能力;划痕实验检测其迁移能力;干扰PSIP1表达后,Western blot检测间质细胞来源的N-cadherin、β-catenin蛋白和转录因子Slug的表达。结果 PSIP1-si RNA转染胶质瘤U87细胞后,PSIP1的m RNA水平及蛋白水平明显下降(P<0.001),U87细胞侵袭和迁移能力下降,与阴性转染组及未转染组相比差异有统计学意义(P<0.001,P<0.001),Western blot显示,间质细胞来源的N-cadherin、β-catenin蛋白表达量降低,同时与上皮间质转化(EMT)相关的转录因子Slug的表达降低。结论在胶质瘤中,抑制PSIP1的表达可抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移,N-cadherin、β-catenin蛋白和转录因子Slug的表达量降低,提示PSIP1可通过调控经典Wnt/β-catenin信号通路来调节Slug的表达,进而调控EMT,从而参与胶质瘤U87细胞的侵袭及迁移。

siRNA干扰cytohesins导IGFR信号减低致前列腺癌细胞中

Cytohesins在前列腺癌的IGFR信号转导中发挥重要作用.siRNA干扰cytohesins可以减低前列腺癌的IGFR信号,表明cytohesins可以成为治疗前列腺癌的一个新靶点.

siRNA干扰技术逆转MHCC97肝癌细胞多药耐药性

目的:探讨小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对人肝癌MHCC97细胞株多药耐药性(multi-drug resistance,MDR)的影响。方法:设计合成1对靶向针对多药耐药基因(multi-drug resistance 1 MDR1)的siRNA,与脂质体转染复合体转染至MHCC97细胞。采用反转录PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR)和Western blot分别检测MDR1 mRNA和P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的表达;MTT法检测细胞对化疗药物的敏感性。结果:RT-PCR和Western blot显示转染siRNA后MDR1 mRNA和P-gp的表达水平均下降。MTT法测定siRNA处理后对细胞的杀伤作用,结果显示转染后MDR1-siRNA组细胞增强了对5-FU、Adriamycin、Vincristine药物的敏感性。结论:siRNA可逆转肝癌细胞的MDR,为提高肝癌的化疗效率提供了一种新方法。

siRNA干扰沉默HOXA9基因对急性白血病K562细胞凋亡的影响

白血病是一种发生于造血组织的恶性疾病,其特点是某一类型白血病细胞在骨髓组织或其他造血组织中呈肿瘤性增生。白血病发病率占儿童恶性肿瘤的第一位。在我国白血病的患者30%是儿童。急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia,AML）约占儿童急性白血病的20%,过去20年,5年生存率已上升至60%[1]。

siRNA干扰CTHRC1可体外抑制甲状腺乳头状癌TPC-1细胞的增殖并诱导凋亡

目的探讨胶原三股螺旋重复蛋白1(CTHRC1)甲状腺乳头状癌TPC-1细胞增殖、凋亡的影响。方法成功筛选干扰甲状腺乳头状癌TPC-1细胞CTHRC1表达的siRNA,以脂质体转染法将siRNA转染甲状腺乳头状癌TPC-1细胞,采用real-time PCR和Western blot检测转染后TCP-1细胞中CTHRC1mRNA和蛋白表达的变化。实验分组:将筛选的干扰序列转染TPC-1细胞作为干扰组(si-CTHRC1组),将随机阴性对照序列转染的TPC-1细胞作为阴性对照组(si-NC组),以不做任何处理TPC-1细胞为空白组(WT组)。采用CCK-8实验检测细胞增殖;流式细胞术AV/PI双染观察各组TCP-1细胞凋亡的变化;采用Western blot法检测各组TPC-1细胞中含剪切型半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(c-Caspase-3)蛋白、剪切型多聚ADP核糖聚合酶1(c-PARP1)蛋白表达水平以及磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)表达水平。结果将筛选出明显抑制TPC-1细胞CTHCR1表达的siRNA转染细胞后,TPC-1细胞中CTHRC1的mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.05)。与WT组和si-NC组相比,si-CTHRC1组的细胞活降低(P<0.05);与对照组相比,si-CTHRC1组的TPC-1细胞细胞凋亡率升高,Western blot实验发现:si-CTHRC1组的c-caspase-3、c-PARP1蛋白表达水平均升高(P<0.05);si-CTHRC1组ERK1/2蛋白的磷酸化水平增加。结论干扰CTHRC1能够抑制TPC-1细胞的增殖并诱导凋亡,此过程可能通过激活ERK1/2信号通路介导。

腺病毒过表达及siRNA干扰人肝癌HepG2细胞对11β-羟基类固醇脱氢酶I表达的影响

目的观察腺病毒(Ad-11β-HSD1)过表达系统及特异性siRNA(siRNA-11β-HSD1)干扰人肝癌HepG2细胞对11β-羟基类固醇脱氢酶I(11β-HSD1)表达的影响。方法应用Ad-11β-HSD1以及siRNA-11β-HSD1转染人肝癌HepG2细胞,用实时荧光定量PCR及Western Blot检测11β-HSD1表达。结果转染72 h后,对照组及腺病毒过表达组细胞中均可见明显GFP荧光,且转染48 h后蛋白水平明显升高;siRNA干扰48 h后,mRNA及蛋白水平均明显降低。结论腺病毒转染可有效过表达11β-HSD1,而siRNA干扰可有效抑制11β-HSD1表达。

siRNA干扰ski基因的表达对人肝癌HepG2细胞生物学功能的影响

目的:设计并化学合成针对原癌基因ski的siRNA分子片段,转染人肝癌HepG2细胞,观察其对HepG2细胞增殖、细胞周期和凋亡等生物学功能方面的影响。方法:设计并化学合成针对原癌基因ski的3个siRNA分子序列,阳离子脂质体法瞬间转染HepG2细胞,运用实时定量PCR法和Western印迹法检测细胞中ski基因在mRNA水平和蛋白水平的变化。然后利用MTT法和流式细胞术检测转染ski-siRNA的HepG2细胞增殖、细胞周期和凋亡等生物学功能方面指标的变化。结果:3对特异性ski-siRNA均有效地抑制了ski基因的表达,以siRNA-B抑制效果最好,可达到70%,而且随着转染时间的延长,ski的表达呈逐步下降趋势。转染ski-siRNA后HepG2细胞的增殖能力明显受到抑制(P<0.05),S期细胞明显减少,是阴性对照组的2倍以上。结论:靶向ski基因的siRNA分子片段可以有效地抑制人肝癌HepG2细胞的生长,使进入S期的细胞明显减少,其作用与下调ski基因的表达有关,ski可能是肝癌治疗的一个潜在靶点。

siRNA干扰牦牛Bmal1基因对颗粒细胞激素分泌的影响

本研究旨在探讨敲低Bmal1基因对体外培养牦牛颗粒细胞雌二醇(E2)和孕酮(P4)分泌的影响。应用siRNA技术下调颗粒细胞中Bmal1基因的表达,利用ELISA试剂盒检测细胞培养液中E2与P4含量,再通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白印迹(Western Blot)检测细胞激素分泌相关基因的表达情况。结果显示:经si-Bmal1转染颗粒细胞后,E2分泌量显著下降,P4分泌量极显著下降;在mRNA检测水平上,激素合成相关基因Cyp19a1、Star的表达量下降;在蛋白检测水平上,Cyp19a1、Star的结果与mRNA表达基本一致。综上表明,敲低Bmal1基因能通过调控相关基因的表达抑制体外培养牦牛颗粒细胞E2和P4的分泌水平,Bmal1基因参与牦牛颗粒细胞激素分泌的调控。

siRNA干扰技术对沉默CKIP-1基因大鼠进展性牙周炎影响的研究

目的:通过siRNA干扰技术沉默络蛋白激酶2-作用蛋白1(CKIP-1)基因,以观察其对大鼠牙周炎发生发展的影响。方法:取SPF级SD大鼠9只,并将其随机分为空白对照组(BC组)、阴性对照组(NC组)、阳性对照组(PC组)(n=3)。其中NC、PC两组均采用双侧上颌第二磨牙细线结扎和注射LPS-PG的方法建立牙周炎模型,并在造模期间对PC组注射CKIP-1 siRNA干扰;NC组注射生理盐水作为对照。造模加干预4周后,分别对所有大鼠的双侧上颌骨进行Micro-CT扫描,分析其骨缺损高度和根分叉处牙槽骨体积的变化;然后再取其双侧上颌骨标本并制作近远中向牙周牙体组织联合切片,常规HE染色观察其牙槽骨破坏及牙周组织炎症反应情况。结果:Micro-CT扫描显示:NC组的骨缺损程度大于PC组,其牙槽骨吸收高度(mm)分别为0.9606±0.1112、0.6759±0.0514,根分叉处牙槽骨体积(%)分别为0.5958±0.014、0.7509±0.0355(P<0.05)。组织学观察显示:相比于PC组,NC组大鼠的牙槽骨吸收更明显,且牙周膜纤维排序紊乱。结论:通过siRNA干扰技术沉默CKIP-1基因后,可减少大鼠牙周炎模型的骨缺损破坏程度及炎症反应。

HL-60细胞诱导分化过程中STIM1 siRNA干扰的电转染研究

目的:以感受器相互作用分子(STIM1)为报告基因优化悬浮培养的二甲基亚砜(DMSO)诱导分化的HL-60细胞的电穿孔转染条件。方法:通过控制电压、电容、电阻、细胞状态等转染条件,采用不同条件组合后用电穿孔法将靶向STIM1的siRNA转入悬浮培养的dHL-60细胞,用荧光显微镜观察转染率,蛋白免疫印记方法检测干扰效率。结果:适当提高电压能提高悬浮培养的dHL-60细胞的转染效率,细胞状态不同干扰效率有所差异,DMSO诱导4 d的dHL-60细胞在电压295V、电容1 180μF、电阻500Ω的条件下转入STIM1 siRNA系列并得到最大干扰效率(约60%)。结论:针对dHL-60细胞这种比较特殊的细胞系来说,电穿孔转染法是一种较好的基因转染方法,通过优化其转染条件,可以提高其对dHL-60细胞的SiRNA干扰效率。

siRNA干扰Caco-2细胞鞘磷脂合酶2(SMS2)基因对药物转运体的影响

目的研究鞘磷脂合酶2(sphingomyelin synthase 2,SMS2)缺损对人结肠癌细胞(colon cancer cell,Caco-2)中药物转运体P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)及多药耐药相关蛋白2(multidrug resistance-associated protein 2,MRP2)的表达与功能的影响。方法 SMS2特异性siRNA转染至Caco-2细胞。采用RT-PCR和real-time PCR检测SMS2-特异性siRNA的干扰效率;采用Western blot法检测siRNA转染后P-gp和MRP2蛋白表达的变化;采用胞内蓄积试验,通过HPLC检测P-gp及MRP2专一性底物罗丹明123及普伐他汀的蓄积含量,分析下调SMS2水平对Caco-2细胞中P-gp及MRP2功能的影响。结果应用siRNA下调SMS2水平后,P-gp和MRP2的蛋白质水平均显著下调;胞内蓄积实验结果显示罗丹明123及普伐他汀的蓄积量明显增加,说明P-gp和MRP2的外排功能减弱。结论SMS2基因表达下调对Caco-2细胞中P-gp和MRP2的表达以及功能均有显著影响。

siRNA干扰β-catenin基因表达情况与喉癌Hep-2细胞增殖、凋亡和侵袭的关系

目的探讨小干扰RNA(siRNA)干扰β-链蛋白(β-catenin)基因表达对喉癌Hep-2细胞增殖、凋亡和侵袭的影响。方法前瞻性选取喉癌Hep-2细胞,随机分为空白对照组、阴性对照组和干扰组,其中干扰组转染靶向β-catenin的siRNA,阴性对照组转染空白siRNA。采用荧光定量PCR和Western-blot检测β-catenin mRNA和蛋白表达,MTT检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,Transell法观察细胞侵袭能力。结果干扰组β-catenin mRNA和蛋白相对表达量分别为(0.304±0.015)和(0.234±0.065),明显低于空白对照组和阴性对照组(P<0.05);干扰组培养48 h和72 h吸光值分别为(0.721±0.250)和(0.942±0.321),明显低于空白对照组和阴性对照组(P<0.05);干扰组细胞凋亡率为(19.10±1.24)%,明显高于空白对照组和阴性对照组(P<0.05);干扰组穿膜细胞数为(22.41±3.25)个,明显低于空白对照组和阴性对照组(P<0.05)。结论干扰β-catenin基因,可抑制喉癌Hep-2细胞增殖和侵袭,促进细胞凋亡。

siRNA干扰沉默HIF-1α基因在舌癌Tca8113细胞侵袭和迁移中的作用机制

目的探讨利用siRNA技术特异性阻断缺氧诱导因子(HIF)-1α基因表达对舌癌Tca8113细胞侵袭和迁移的影响。方法取指数生长期细胞消化计数后按2×105个/孔接种于6孔细胞培养板中,待细胞融合至40%~50%时,将针对HIF-1α的siRNA序列应用LipofectamineTM2000转染入Tca8113细胞(siRNA HIF-1α组,干扰组)。半定量RT-PCR及Western印迹法检测HIF-1α的m RNA及蛋白,四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡率,细胞侵袭实验和划痕实验检测细胞的侵袭和迁移能力。结果 siRNA可以有效沉默Tca8113细胞HIF-1α基因;干扰组细胞增殖较对照组明显受到抑制,且与细胞凋亡有关,凋亡率显著高于对照组(P<0.05);,siRNA HIF-1α基因转染后的Tca8113细胞黏附能力降低,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);侵袭能力也下降。结论 siRNA能够有效沉默HIF-1α基因,抑制舌癌Tca8113细胞侵袭和迁移,在某种程度上可以改善舌癌细胞的恶性表型,为舌癌的治疗提供思路。

siRNA干扰对Hela细胞株VEGF表达的影响

目的:探讨血管内皮生长因子(VEGF)siRNA干扰对宫颈癌Hela细胞株VEGF的影响。方法:设计合成VEGFsiRNA1、2、3号链,体外脂质体介导转染宫颈癌Hela细胞株,半定量RT-PCR及Western blot分析转染效果。结果:转染VEGF siRNA1、2号链后,宫颈癌Hela细胞株VEGFmRNA表达明显下降,但是VEGF蛋白水平下降不明显。结论:VEGF siRNA转染宫颈癌Hela细胞株可下调细胞中VEGFmRNA的表达,不同的siRNA下调mRNA效率不同。作为基因沉默的一个重要工具,siRNA干扰有望成为治疗宫颈癌一种新方法。

MDRI的siRNA干扰口腔Tca8ll3/DDP细胞表达的研究

目的探讨小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA)对口腔鳞癌多药耐药基因mdr1(MDRI)及其表达产物P-糖蛋白(permeability-glyco-protein,P-gp)的干扰作用。方法体外构建针对MDR1的小干扰RNA,将其转染至人舌癌耐药细胞系Tca8113/DDP,采用RT-PCR法检测转染前后MDR1 m RNA的表达;采用免疫细胞化学技术比较转染前后P-gp的表达;采用MTT法检测转染前后肿瘤耐药细胞对顺铂的敏感性。结果 Tca8113/DDP细胞经MDR1-si RNA转染后48 h的转染率达最高,为71.3%;转染后mdr1 m RNA表达较对照组显著降低,降低率为68.32%,转染48 h后P-gp的表达较对照组明显降低;si RNA可显著提高Tca8113/DDP细胞对DDP的敏感性,逆转其耐药性,耐药倍数为2.05。结论 si RNA可以明显干扰口腔鳞癌MDR1及相应蛋白P-gp的表达。

siRNA干扰ARK5蛋白表达对U251细胞侵袭潜能影响机制探讨

目的:探讨siRNA干扰降低腺苷酸活化蛋白激酶5(AMPK-related protein kinase 5,ARK5)表达对U251细胞侵袭潜能的影响及其机制。方法:采用蛋白质印迹法检测U251细胞中ARK5表达。应用siRNA干扰技术转染U251细胞株,并采用蛋白质印迹法检测瞬时转染后ARK5蛋白表达情况。通过体外侵袭实验检测细胞转染后侵袭能力的变化。ARK5下降后,蛋白质印迹法检测间质细胞来源的YKL-40、N-cadherin、Vimentin蛋白和调节因子Snail、Slug、Twist1和Zeb1的表达。结果:转染ARK5质粒的U251细胞ARK5表达下降。ARK5表达降低的U251细胞侵袭并穿透Matrigel膜基质的细胞数量为22,U251对照组为41,SCR/U251对照组为42,两两比较,ARK5表达降低的实验组透膜数比两对照组少(P<0.001),同时蛋白质印迹法结果显示,YKL-40、N-cadherin和Vimentin蛋白表达量降低,与间质转化相关的转录因子仅Snail的表达降低,而转录因子Slug、Twist1和Zeb1表达无明显改变。结论:应用siRNA干扰技术降低ARK5蛋白的表达使U251细胞侵袭转移能力降低,同时YKL-40、N-cadherin和Vimentin蛋白和转录因子Snail的表达量降低,提示ARK5蛋白表达降低可通过调节间质转化影响U251细胞的侵袭。

子宫内膜癌组织中K-Cl共转运体1的表达及siRNA干扰其表达对子宫内膜癌HEC-1B细胞增殖的影响

目的:探讨K-Cl共转运体1(K-Cl cotransporter 1,KCC 1)mRNA在子宫内膜癌组织中的表达及小干扰RNA(smallinterfering RNA,siRNA)干扰其表达对子宫内膜癌HEC-1B细胞增殖能力和细胞周期的影响。方法:应用荧光定量PCR的方法检测正常子宫内膜和子宫内膜癌组织中KCC 1 mRNA的表达。设计并合成KCC 1特异性的siRNA,转染子宫内膜癌HEC-1B细胞后,应用RT-PCR、Western印迹法、MTT法和FCM法分别检测HEC-1B细胞中KCC 1 mRNA和蛋白的表达、细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的变化。结果:子宫内膜癌组织中KCC 1 mRNA的表达较正常子宫内膜组织明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。KCC1特异性siRNA能明显抑制HEC-1B细胞中KCC1 mRNA和蛋白的表达(P<0.05),且HEC-1B细胞的增殖能力明显下降(P<0.05);细胞周期分析显示细胞明显阻滞于G0/G1期,与对照组比较,细胞凋亡增加(P<0.05)。结论:KCC1基因与子宫内膜癌有关,参与细胞周期的调节,具有促进细胞增殖的能力。

siRNA干扰MACC1表达对前列腺癌细胞株PC-3生长与侵袭影响研究

目的结肠癌转移相关基因1(metastasis-associated in colon cancer 1,MACC1)在肿瘤侵袭和转移中起重要作用,在前列腺癌中的研究较少,本研究探讨siRNA转染下调MACC1表达对前列腺癌细胞株PC-3增殖和侵袭的影响。方法采用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription PCR,RT-PCR)法检测10例前列腺癌和其癌旁组织及4种前列腺癌细胞株(LNCap、PC-3、DU145、C4-2)MACC1mRNA的表达;将前列腺癌细胞株PC-3分为实验组、阴性对照组和空白对照组,实验组转染MACC1特异性小干扰RNA(small RNA interference,siRNA)(MACC1siRNA),阴性对照组转染阴性对照siRNA,空白对照组不做处理。RT-PCR法及蛋白质印迹法检测siRNA转染前后MACC1mRNA及蛋白水平的变化,四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测转染后PC-3细胞增殖变化,Transwell小室法检测PC-3细胞侵袭能力的变化,蛋白质印迹法检测Met/MAPK信号通路蛋白改变。结果 10例前列腺癌组织中MACC1mRNA相对表达量为0.82±0.27,高于癌旁组织的0.09±0.05,t=23.20,P<0.001;前列腺癌细胞株PC-3、DU145和C4-2 MACC1mRNA的表达分别为0.86±0.19、0.65±0.23和0.77±0.23,高于LNCap细胞的0.17±0.07。实验组PC-3细胞转染siRNA后,MACC1mRNA表达为0.16±0.03,低于阴性对照组的0.79±0.04,t=7.91,P<0.001;也低于空白对照组的0.81±0.34,t=8.61,P<0.001。实验组MACC1蛋白表达量为0.10±0.01,显著低于阴性对照组的0.39±0.045,t=11.21,P<0.001;也低于空白对照组的0.41±0.10,t=11.73,P<0.001;MACC1siRNA组PC-3细胞增殖能力在72h分别为0.58±0.65,低于阴性对照组的1.18±0.10和空白对照组的1.23±0.05,P<0.001;MACC1siRNA组PC-3细胞侵袭的细胞数目为126.0±9.8,低于阴性对照组233.3±12.0及空白对照组242.3±11.5,P<0.05。转染后Met、p-MEK1/2和p-ERK1/2的MACC1siRNA蛋白相对表达量分别为0.47±0.03、0.34±0.03和0.94±0.03,较对照组的0.26±0.04、0.10±0.11和0.10±0.12明显降低,P<0.05;MEK1/2和ERK1/2蛋白相对表达量无明显下降,P>0.05。结论 MACC1可能通过上调Met和MAPK信号通路促进前列腺癌细胞的恶性行为。