限制性siRNA干涉文库的构建以及影响HeLa细胞增殖新功能基因的扫描

利用RNA干涉文库进行大规模高通量的功能基因扫描,已成为发现新功能基因的重要方式和手段.为了寻找在细胞增殖和分化过程中的新功能基因,根据斯坦福大学公布的与人类胚胎干细胞和造血干细胞增殖和分化过程中有关基因的基因芯片的分析结果,组建了与细胞增殖和分化有关的RNA限制性干涉文库.该文库包括靶向各类基因的载体,如包括转录因子、各类蛋白激酶、细胞周期调控蛋白以及一些未知功能基因在内的225个基因.利用这个限制性RNA干涉文库对控制HeLa细胞增殖的基因进行筛选.并通过WST-1高通量检测,发现了2个同HeLa细胞增殖相关的基因:CNKSR3(Homo sapiens CNKSR family member 3)和Fosl2(Homo sapiens FOS-like antigen 2),并初步证实:沉默CNKSR3会促进HeLa细胞的增殖,而沉默Fosl2则抑制HeLa细胞的增殖功能.

siRNA抑制survivin基因周期的影响表达对HeLa细胞

目的设计靶向survivin基因的干涉片段，构建真核表达载体pSUPER／survivin并转染宫颈癌HeLa细胞，探讨siRNA抑制survivin表达对联合1射线宫颈癌HeLa细胞周期的影响。方法化学合成干涉引物，退火获得survivin基因的干涉片段，连入pSUPER载体并测序。将测序正确的pSUPER／survivin载体转染HeLa细胞株，RT—PCR法和流式细胞术检测HeLa细胞中survivin基因的表达，流式细胞术检测转染联合＇射线照射后各组细胞的细胞周期数据。结果本实验成功的构建了pSUPER／survivin载体。转染pSUPER／survivin的HeLa细胞其survivin基因表达水平明显低于未转染的HeLa细胞及转染空载体pSUPER的HeLa细胞。1射线照射后，转染pSUPER／survivin的HeLa细胞发生了S期细胞比例下降，及G2／M期阻滞。结论成功的构建了pSUPER／survivin载体，siRNA干涉survivin可以作为提高放射敏感性的潜在分子靶点，通过减少S期细胞比例，促进肿瘤细胞凋亡，通过增加G2／M期阻滞增加放射线的杀伤。

利用siRNA抑制HER-2表达的研究

目的利用siRNA抑制人乳腺癌MCF-7细胞中HER-2基因的表达。方法针对HER-2mR-NA设计了5条siRNA,并构建相应的表达质粒,将质粒转染MCF-7乳腺癌细胞,筛选稳定表达株,利用RT-PCR分析siRNA对细胞中HER-2mRNA的降解作用;利用流式细胞术分析细胞表面HER-2蛋白的表达;利用裸鼠进行体内成瘤性实验,用免疫组化法检测瘤组织中HER-2的表达。结果siRNA3P能明显降低MCF-7细胞中HER-2mRNA的丰度;流式细胞分析表明,其中siRNA2P和3P稳定转染的MCF-7细胞表面HER-2的表达明显降低;五种表达不同siRNA的MCF-7细胞在裸鼠体内的成瘤性均有所降低,并且瘤组织中HER-2蛋白的表达也明显减少。结论靶向HER-2mRNA的siRNA能在体内外有效抑制HER-2的表达,可用于乳腺癌的基因治疗。

RNA干涉的研究进展

RNA干涉(RNA interfering)是目前分子生物学领域的研究热点之一,RNAi是一种极为保守的生物机制,而且已在很多种生物中发现了该现象,或是获得了成功的干涉实验。由于RNAi具有良好的技术优越性,使其在很多领域,如基因功能验证、疾病治疗方面有着广阔的应用前景。

敲低小胶质细胞中过氧还原素6(PRDX6)降低氧糖剥夺再复氧神经元的存活

目的观察敲低小胶质细胞中过氧还原素6(PRDX6)对氧糖剥夺再复氧(OGD/R)神经元存活的影响。方法小胶质细胞采用PRDX6-siRNA慢病毒感染,同时培养基中加入非Ca2+依赖性磷脂酶A2(i PLA2)活性抑制剂MJ33,24 h后与原代神经元共培养,并进行OGD/R处理。实验分为正常组、OGD/R组、阴性对照siRNA处理的OGD/R组、PRDX6-siRNA处理的OGD/R组、PRDX6-siRNA联合MJ33处理的OGD/R组。Western blot法检测小胶质细胞PRDX6蛋白的表达,实时定量PCR检测小胶质细胞PRDX6 mRNA的表达。ELISA检测i PLA2活性;MTS、乳酸脱氢酶(LDH)法检测神经元的存活率;采用比色法检测超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量以反映神经元的氧化应激水平。结果与OGD/R组比较,PRDX6-siRNA处理的神经元存活率降低,MDA增加、SOD降低、氧化应激损伤加重;与PRDX6-siRNA组比较,同时加入i PLA2活性抑制剂MJ33组神经元存活率增加,MDA降低、SOD增加、氧化应激水平下降。结论小胶质细胞PRDX6对神经元氧糖剥夺损伤有保护作用,而i PLA2活性对PRDX6的作用有影响。

Arl8a与树突状细胞TLR4-TRIF信号途径的相关性

目的 探讨ADP-核糖基化因子样8A（ADP-ribosylation factor-like 8A,Arl8a）与树突状细胞（dendritic cell,DC）中TLR4-TRIF-GEFH1-RhoB信号途径的相关性.方法 从野生型和TRIF敲除基因（TRIFKO）小鼠中分离和培养DC,LPS刺激后收集细胞扩增总cDNA,通过实时定量PCR检测Arl8a的mRNA表达.然后用鸟嘌呤核苷酸交换因子H1（GEFH1）的siRNA转染来自野生型小鼠的DC,进行LPS刺激或未刺激处理并检测Arl8a的mRNA表达.再用GEFH1和Arl8a的siRNA转染DC,LPS刺激后检测RhoB的mRNA表达.结果 在LPS刺激后,Arl8a的mRNA表达在野生型小鼠的DC中增加,在TRIFKO小鼠的DC中则未被上调.此外,在野生型小鼠中Arl8a的mRNA上调可被GEFH1的siRNA明显抑制（P＜0.01）.而Arl8a和GEFH1的siRNA均能显著抑制RhoB的mRNA表达（P＜0.01）.结论 Arl8a的表达与DC的TRL4-TRIF途径有关,并且在转录水平与GEFH1和RhoB相关.