insig-1基因siRNA干扰质粒的构建及对炎症状态下细胞胆固醇代谢的影响

目的构建针对insig-1基因的siRNA表达载体,观察其对炎症状态下RAW264.7小鼠巨噬细胞胆固醇代谢的影响。方法根据insig-1核苷酸序列,设计并构建针对insig-1基因mRNA的3个特异性siRNA表达载体(si-1、si-2、si-3)和1个无同源性的阴性对照载体(si-nc),经酶切和测序鉴定确认siRNA载体构建成功后,转染RAW264.7小鼠巨噬细胞,RT-PCR、免疫组化法检测insig-1基因的表达,筛选出最佳抑制基因后,应用酶学方法和油红O染色观察炎症处理后RAW264.7细胞内胆固醇含量的变化。结果经酶切证实,siRNA表达载体构建成功,RT-PCR、Western blot、免疫组化法显示与未转染组相比,si-1、si-2、si-3组RAW264.7细胞中insig-1的mRNA和蛋白表达水平均明显降低(P<0.05),其中si-2干扰效果最强。酶学方法和油红O染色结果表明,炎症状态下细胞insig-1沉默后胆固醇的含量和油红O颗粒增多。结论成功构建了insig-1基因siRNA干扰质粒,insig-1缺失对炎症状态下细胞胆固醇摄取有促进作用。

抑制Coronin-1基因表达的siRNA载体的构建和筛选

目的:构建和筛选能高效、特异性抑制Coronin-1基因表达的siRNA表达载体。方法:提取鼠巨噬细胞总RNA,RT-PCR扩增Coronin-1基因目标序列,克隆入pSEB-HUS真核表达质粒,构建pSEB-HUS-C重组质粒。将设计、合成的3条siRNA及阴性对照分别克隆入pSEB-HUS-C,构建重组pSEB-HUS-C1、pSEB-HUS-C2、pSEB-HUS-C3及pSEB-HUS-CN质粒。将干涉质粒瞬时转染A549细胞,通过绿色荧光信号观察、实时定量PCR和Western blot法检测其对Coro-nin-1基因表达的影响。结果:经双酶切及测序证实,所构建siRNA表达载体目的基因大小、序列与预期相符。经瞬时转染A549细胞后,其中的pSEB-HUS-C3能明显抑制Coronin-1 mRNA的表达和Coronin-1蛋白的合成,抑制率分别是75.9%和75.1%。结论:成功构建并筛选出高效、特异性抑制Coro-nin-1表达的siRNA表达载体,为进一步研究Coronin-1在巨噬细胞中的作用奠定基础。

绵羊ApoER2基因克隆及其干扰质粒对睾丸共培养细胞硒蛋白表达的影响

本研究旨在克隆绵羊ApoER2基因,构建ApoER2-siRNA质粒载体,研究ApoER2基因沉默对睾丸共培养细胞SelP和PHGPx表达的影响。利用RT-PCR技术,克隆ApoER2序列,在此基础上构建4种pGPU6/GFP/Neo—ApoER2-siRNA质粒表达载体,利用脂质体将其转染到体外共培养绵羊睾丸细胞中,采用Real—time PCR和Western blotting方法,检测其抑制效应,并研究ApoER2基因沉默对Sel P和PHGPx mRNA表达的影响。本研究成功获得了长度为2 490 bp的绵羊睾丸ApoER2完整编码区序列,共编码892个氨基酸,绵羊ApoER2核苷酸序列与牛的同源性最高,相似性为97.7%。ApoER2-siRNA-1565和ApoER2-siRNA-2567位点重组质粒的干扰效果较好(P<0.01),选取ApoER2-siRNA-2567重组质粒,结果显示转染组Sel P和PHGPx表达量显著降低(P<0.01)。获得了绵羊ApoER2编码区序列和有效抑制该基因表达的2个质粒载体,ApoER2沉默可能影响了睾丸硒蛋白Sel P和PHGPx的表达,为进一步研究ApoER2转运硒机理提供了理论依据。

成釉细胞瘤中MMP-2的表达及RNA干扰的抑制作用

目的:研究MMP-2在成釉细胞瘤中的表达和RNA干扰对成釉细胞瘤细胞中MMP-2基因的沉默效应。方法:培养成釉细胞瘤细胞,应用免疫组织化学方法检测成釉细胞瘤中MMP-2的表达;体外构建MMP-2靶向siRNA质粒表达载体,将siRNA质粒表达载体转染原代培养的成釉细胞瘤细胞,激光共聚焦显微镜检测siRNA质粒表达载体的转染效率,RT-PCR检测成釉细胞瘤细胞中MMP-2mRNA的改变,明胶酶谱法检测MMP-2的变化,应用SPSS11.0统计软件中的t检验对结果进行统计学分析。结果:成釉细胞瘤中MMP-2呈阳性表达,siRNA质粒表达载体对原代培养的成釉细胞瘤细胞的转染率为41.8%;转染后,成釉细胞瘤细胞的MMP-2mRNA表达水平显著降低,酶原性MMP-2和活性MMP-2显著减少,P<0.05。结论:体外构建的MMP-2靶向siRNA质粒表达载体可以转染体外培养的成釉细胞瘤细胞,并导致MMP-2基因沉默。