猪杀菌/通透性增加蛋白基因siRNA载体构建及干扰效果评价

本研究旨在构建并筛选猪(Sus scrofa)BPI基因的高效siRNA干扰载体,为在细胞水平上研究猪BPI基因的功能和作用机制提供基础。参照猪BPI基因(GenBank登录号:EF436278)全长编码区序列,设计其特异性发夹siRNA干扰片段,并将其克隆插入pcDNA 6.2-GW/EmGFPmiR干扰载体中,构建猪BPI基因4个干扰siRNA表达载体RB1、RB2、RB3和RB4,1个阴性对照NC,并通过PCR和测序进行验证,构建成功后转染猪小肠上皮细胞IPEC-J2并检测其干扰效率。结果发现,所构建的4个特异性siRNA载体均可显著降低猪BPI基因mRNA表达(P<0.05),其中RB4载体干扰效果最好,其干扰效率达到69%。本研究成功筛选可靶向干扰猪BPI基因的高效siRNA,为今后在细胞水平进一步研究BPI基因对猪肠道革兰阴性菌感染抗性的作用及其机制奠定了试验基础。

透明质酸键合分枝状聚乙烯亚胺作为siRNA载体的研究

目的构建以透明质酸为骨架材料键合分枝状聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI,相对分子质量为25 000)的新型转siRNA载体,研究其对肿瘤细胞siRNA的转染。方法透明质酸(hyaluronicacid,HA)作为骨架材料,利用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐[1-ethyl-3-(3-dimethyl-laminopropyl)carbodiimide hydrochloride,EDC.HCl]交联剂,与PEI嫁接,形成HA-PEI聚合载体材料。用核磁共振氢谱(1H-NMR)对载体材料进行化学表征,以确定其结构。用凝胶电泳阻滞实验观察HA-PEI与小干扰siRNA的结合能力,MTT法检测siRNA/PEI-HA复合体的细胞毒性,用原子力显微镜观察siRNA/PEI-HA复合体的大小。用B16F1细胞株进行基因沉默效率实验。结果质量分数为24%的PEI偶联到HA上,HA-PEI与siRNA在体积比为3∶1时可以完全缩合siRNA,其大小约20 nm,在相同浓度下HA-PEI的毒性低于PEI。体外转染实验显示,在含高血清条件下,siRNA/PEI-HA对B16F1细胞的基因沉默效率比PEI高。结论以透明质酸为骨架材料键合聚乙烯亚胺形成转基因载体是一种有潜在研究价值的新型靶向非病毒载体。

透明质酸键合分枝状低分子量聚乙烯亚胺作为siRNA载体的研究

通过构建透明质酸键合低分子量聚乙烯亚胺的低毒性siRNA载体,探究其转染si RNA的效果。利用核磁共振氢谱确定透明质酸与低分子量聚乙烯亚胺嫁接形成复合物的结构,并通过MTT方法检测其对细胞的毒性。采用凝胶电泳法确定siRNA与复合载体的结合比,利用粒度仪对其粒径大小、带电量等进行表征,并通过透射电子显微镜观察其形态。通过复合载体在B16F1细胞内,观察其基因沉默效率。结果表明:当siRNA与复合载体的质量比为1∶20时,其表面带电量约为+0. 3 m V,粒子直径约为113. 7 nm,形态均匀呈球形,分散均匀。其对细胞毒性远远小于高分子量聚乙烯亚胺,但转染效果较好。因此,透明质酸键合低分子量聚乙烯亚胺是一种低毒、高效的新型非病毒载体。

抑制Coronin-1基因表达的siRNA载体的构建和筛选

目的:构建和筛选能高效、特异性抑制Coronin-1基因表达的siRNA表达载体。方法:提取鼠巨噬细胞总RNA,RT-PCR扩增Coronin-1基因目标序列,克隆入pSEB-HUS真核表达质粒,构建pSEB-HUS-C重组质粒。将设计、合成的3条siRNA及阴性对照分别克隆入pSEB-HUS-C,构建重组pSEB-HUS-C1、pSEB-HUS-C2、pSEB-HUS-C3及pSEB-HUS-CN质粒。将干涉质粒瞬时转染A549细胞,通过绿色荧光信号观察、实时定量PCR和Western blot法检测其对Coro-nin-1基因表达的影响。结果:经双酶切及测序证实,所构建siRNA表达载体目的基因大小、序列与预期相符。经瞬时转染A549细胞后,其中的pSEB-HUS-C3能明显抑制Coronin-1 mRNA的表达和Coronin-1蛋白的合成,抑制率分别是75.9%和75.1%。结论:成功构建并筛选出高效、特异性抑制Coro-nin-1表达的siRNA表达载体,为进一步研究Coronin-1在巨噬细胞中的作用奠定基础。

大鼠结膜囊成纤维细胞TGFβ_2特异性siRNA的筛选及其载体构建的研究

目的筛选结膜囊成纤维细胞转化生长因子β2(TGFβ2)特异性siRNAs,并构建其载体。方法采用体外转录法合成4个TGFβ2siRNAs(L1、L2、L3、L4),分别转染体外培养的大鼠Tenon’s囊成纤维细胞,以未转染细胞作为对照,转染后48h采用RT-PCR技术检测所合成的siRNAs对TGFβ2mRNA表达的干扰作用;在此基础上,再构建有干扰作用siRNA的载体。结果与对照组相比,转染48h后,仅L4能够使大鼠Tenon’s囊成纤维细胞TGFβ2的mRNA表达水平明显下调,其余3条TGFβ2siRNAs未产生明显的干扰效果。经过测序检测证明成功构建了有干扰效果TGFβ2siRNA的载体。结论不同的TGFβ2siRNA对大鼠Tenon’s囊成纤维细胞TGFβ2mRNA表达具有不同的干扰效能;能够构建出有干扰效能的TGFβsiRNA特异性载体。

hTERT-siRNA表达载体的构建及对MCF-7细胞生长、端粒酶活性的抑制作用

目的构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的RNA干扰(RNAi)表达载体,并研究该载体对乳腺癌MCF-7细胞端粒酶活性及细胞增殖的影响,为针对端粒酶的乳腺癌基因治疗提供新的途径。方法设计针对人端粒酶逆转录酶催化亚基(hTERT)的干扰靶序列TGTTCAGCGTGCTCAACTA,构建重组siRNA表达质粒pGenesil-hTERT,同时构建不针对任何基因的阴性对照重组pGenesil-HK。两种重组质粒经酶切、电泳分析和测序鉴定后,用脂质体转染法分别转染乳腺癌MCF-7细胞,应用端粒酶重复序列扩增聚合酶链反应(TRAP-PCR)及聚丙烯酰胺凝胶电泳检测端粒酶活性,流式细胞仪测定细胞凋亡率。结果酶切电泳测序分析表明插入序列正确,重组质粒构建成功。转染pGenesil-hTERT的MCF-7细胞,凝胶电泳见端粒酶特征性条带明显减少,端粒酶活性受到明显抑制;pGenesil-hTERT转染细胞后凋亡率较对照组明显升高(P<0.01),且转染48h凋亡率最高,达54.7%±2.41%。结论hTERT-siRNA可有效抑制乳腺癌MCF-7细胞端粒酶活性、促进细胞凋亡,此法有望应用于肿瘤基因治疗。

HPV16 E7 siRNA表达载体对宫颈癌CaSki细胞增殖及成瘤性的影响

目的:通过载体介导的RNA干扰技术干扰E7癌基因的表达,探讨HPV16E7小干扰RNA(siRNA)表达载体对宫颈癌CaSki细胞增殖及成瘤性的影响,以及成为宫颈癌基因治疗新策略的可行性。方法:利用脂质体将HPV16E7特异性siRNA表达载体、空载体转染CaSki细胞,分别命名为CaSki-S、CaSki-P。通过荧光定量RT-PCR及流式细胞仪检测CaSki、CaSki-S、CaSki-P3种细胞E7mRNA和蛋白的变化,通过流式细胞仪及MTT法检测3种细胞的细胞周期及生长曲线变化,并检测3种细胞在裸鼠体内成瘤性及生长活性的差异。结果:荧光定量RT-PCR及流式细胞仪检测显示,CaSki-S细胞E7基因mRNA和蛋白的表达明显低于CaSki细胞,抑制率分别为92.86%、84.21%。MTT法检测显示,CaSki-S细胞生长明显慢于CaSki细胞。流式细胞仪检测细胞周期显示,CaSki-S细胞与未转染组CaSki细胞比较,G1期细胞比例明显增加,S期细胞比例则明显减少。裸鼠体内成瘤性及生长活性显示CaSki-S细胞显著低于CaSki细胞。而CaSki-P细胞无论是在E7mRNA和蛋白的表达,还是在肿瘤细胞生长、细胞周期的改变及成瘤性方面都与CaSki细胞无明显差异。结论:HPV16E7siRNA表达载体能有效地抑制宫颈癌CaSki细胞E7基因的表达,部分逆转其恶性表型。因此它有望成为宫颈癌基因治疗的新策略之一。

HPV16 E7 siRNA表达载体对宫颈癌CaSki细胞生物学活性的影响

目的探讨人乳头瘤病毒16型(HPV16)E7基因小干扰RNA(siRNA)表达载体对宫颈癌CaSki细胞生物学活性的影响。方法利用脂质体HPV16 E7特异性siRNA表达载体(HPV16-E7Si)、空载体(CaSki-Si)转染CaSki细胞,荧光定量RT-PCR、流式细胞仪检测HPV16-E7Si、CaSki-Si细胞E7 mRNA和蛋白的变化;流式细胞仪及MTT法检测2种细胞的细胞周期及生长曲线变化,并检测2种细胞对顺铂的敏感性。结果成功获得沉默E7基因的克隆细胞株CaSki-E7Si及阴性对照CaSki-Si;CaSki-E7Si细胞生长明显慢于CaSki-Si细胞(P<0.05),且前者细胞的凋亡峰明显增多。2种细胞加用顺铂作用48 h后发现,CaSki-Si细胞周期阻滞在S～G2期,HPV16-E7Si阻滞在G0～1期。结论 HPV16 E7 siRNA表达载体能有效地抑制宫颈癌CaSki细胞E7基因的表达,促进肿瘤细胞凋亡,并增加顺铂的敏感性。

siRNA脂质纳米输送载体的研究进展

siRNA能高效且特异地阻断内源性同源基因的表达即RNA干涉(RNAi).RNAi在临床中的应用需要开发安全有效的输送系统,脂质纳米输送载体是一种具有发展潜力的siRNA输送系统.siRNA-脂质复合物的形成主要通过静电相互作用,静电作用必须足够强以至于载体在运输过程中不释放siRNA,而载体到达治疗部位时,解聚释放出siRNA.载体的粒径应小于100 nm,以利于细胞的摄取和透过特定部位的血管开窗.为了减少网状内皮系统(RES)的摄取和延长载体的循环时间,载体的表面由聚乙二醇修饰.本文主要综述了构建siRNA输送载体的基本要求.

端粒酶逆转录酶启动子hTERT／U6嵌合启动子的siRNA表达载体的构建及鉴定

目的构建有hTERT/U6嵌合启动子的小干扰RNA(small interfere RNA,siRNA)表达载体,并用分子生物学的技术和方法验证其对肝癌细胞SMMC-7721的效应。方法构建siRNA-EGFP-PTZU6+1表达载体,将其转染到稳定表达EGFP的肝癌细胞株7721(EGFP-7721),观察细胞荧光的变化及RT-PCR,Western blot筛选出更有效的siRNA-EGFP-PTZU6+1载体。PCR扩增端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase promoter,hTERT)启动子的核心序列,构建针对EGFP基因的hTERT/U6嵌合启动子siRNA表达载体(EGFP-siRNA-PTZU6+1-U6/hTERT),正向和反向插入的hTERT启动子各1个,并将其转染至EGFP-7721细胞中,RT-PCR验证其效应。结果RT-PCR,Western blot结果表明两重组质粒siRNA-EGFP-PTZU6+1转染EGFP-7721细胞后EGFP基因的表达无统计学差异,但与对照组比较均显著抑制了EGFP基因(P<0.01)。而且,RT-PCR结果显示,反向插入的重组质粒EGFP-siRNA-PTZU6+1-U6/hTERT与对照组相比显著抑制了EGFP基因的表达(P<0.05)。结论构建的含hTERT/U6嵌合启动子的siRNA表达载体在肝癌细胞中具有功能活性,为探讨基因的靶向治疗奠定了基础。

siRNA表达载体对宫颈癌Caski细胞凋亡和增殖的影响

目的:观察HPV16 E6 siRNA表达载体对宫颈癌Caski细胞凋亡和增殖的影响。方法:利用脂质体将HPV16 E6特异性siRNA表达载体转染Caski细胞,通过荧光定量RT-PCR检测E6 mRNA的变化,流式细胞仪检测E6蛋白和细胞凋亡率的变化,MTT法和细胞克隆法检测细胞增殖的变化。结果:HPV16 E6 siRNA表达载体可明显抑制Caski细胞E6 mRNA和E6蛋白的表达,抑制率分别为89.5%和98.1%;表达载体可明显增加细胞凋亡率,抑制细胞的增殖和克隆的形成。结论:HPV16 E6siRNA表达载体可以特异高效地抑制宫颈癌Caski细胞E6基因的表达,增加细胞的凋亡,抑制肿瘤细胞增殖和克隆的形成。

siRNA腺病毒载体预防兔酒精性股骨头坏死的动物实验研究

目的观察靶向PPARγ基因siRNA腺病毒载体预防兔酒精性股骨头坏死(ONFH)的作用效果。方法新西兰种家兔60只,随机分为5组,每组12只。正常对照组(N):采用灌胃法,给予10%葡萄糖溶液10ml/(kg·d);单纯马血清致敏组(H):马血清致敏后,给予同量10%葡萄糖灌胃,作为对照;马血清致敏+酒精组(M):马血清致敏后,采用灌胃法,给予烈性白酒(含酒精46%,V/V)10ml/(kg·d),作为模型组;酒精+空载体组(CO):马血清致敏后灌酒,将空载体组病毒滴液注入动物一侧股骨头内;马血清致敏+酒精+重组腺病毒组(S):实验组,马血清致敏后灌酒,将siRNA腺病毒滴液注入动物一侧股骨头内。在灌酒后第4、8周末分批处死动物,观察其股骨头病理学变化。RT-PCR检测股骨头组织中PPARγmRNA和Osteocalcin mRNA的表达。结果M、CO组中,PPARγmRNA高表达,Osteocalcin mRNA低表达,空骨陷窝百分比及最大脂肪细胞平均直径明显增大、骨小梁面积分数降低,与N、H组相比差异均有统计学意义;S组中,PPARγmRNA低表达,Osteocalcin mRNA高表达,空骨陷窝百分比、最大脂肪细胞平均直径、骨小梁面积分数均与H、N组接近,差异均无统计学意义。结论靶向PPARγ基因siRNA腺病毒载体能够有效阻断酒精诱导的家兔股骨头内骨髓基质细胞内PPARγmRNA表达及成脂分化,预防酒精性ONFH的发生。

siRNA表达载体抑制宫颈癌SiHa细胞增殖的实验研究

目的观察HPV16E7 siRNA表达载体对宫颈癌SiHa细胞增殖的影响。方法利用脂质体将HPV16E7特异性siRNA表达载体转染SiHa细胞,通过荧光定量RT-PCR检测E7 mRNA的变化;流式细胞仪检测E7蛋白的变化和细胞周期的分布;MTT法检测细胞增殖的变化。结果HPV16E7 siRNA表达载体可明显抑制SiHa细胞E7 mRNA和E7蛋白的表达,抑制率分别为92.15%、84.30%;阻滞SiHa细胞由G1期进入S期;抑制细胞的生长。结论HPV16E7 siRNA表达载体可以特异高效地抑制宫颈癌SiHa细胞E7基因的表达,从而调控肿瘤细胞周期,抑制肿瘤细胞增殖。

端粒酶逆转录酶启动子hTERT/U6嵌合启动子的siRNA表达载体的肿瘤靶向性分析

目的:体外研究siRNA-EGFP-hTERT/U6-PTZU6+1表达载体在肿瘤细胞中的靶向性.方法:常规培养稳定表达绿色荧光蛋白的肝癌SMMC-7721细胞株(EGFP-7721)和稳定表达绿色荧光蛋白的人正常成纤维细胞株HELF(EGFP-HELF).以PTZU6+1质粒转染EGFP-7721细胞和EGFP-HELF细胞为空白质粒组,siRNA-EGFP-PTZU6+1质粒转染EGFP-7721细胞和EGFP-HELF细胞为实验对照组,将siRNA-EGFP-hTERT/U6-PTZU6+1质粒转染EGFP-7721细胞和EG-FP-HELF细胞作为实验组,用real-time SYBR Green PCR和Western Blot鉴定siRNA-EGFP-hTERT/U6-PTZU6+1对两种细胞株的绿色荧光蛋白表达的影响.结果:正向和反向的重组质粒siRNA-EGFP-hTERT/U6-PTZU6+1转染EGFP-HELF细胞与空白质粒比较,EGFP基因表达无差异(P>0.05),而转染稳定表达绿色荧光蛋白的7721后仅反向的siRNA-EG-FP-hTERT/U6-PTZU6+1重组质粒抑制EGFP基因的表达(P<0.01).siRNA-EGFP-PTZU6+1质粒与空白质粒组比较,在EGFP-7721和EGFP-HELF细胞株间,EGFP基因的表达均具有统计学差异(P<0.01).结论:反向插入的siRNA-EGFP-hTERT/U6-PTZU6+1重组质粒在肿瘤细胞具有一定靶向性,为进一步探讨基因的靶向治疗奠定了基础.

卡氏肺孢子胸腺嘧啶核苷酸合酶基因siRNA表达载体的构建和鉴定

目的:构建和鉴定大鼠卡氏肺孢子(Pneumocystis carinii,PC)胸腺嘧啶核苷酸合酶(Thymidylate synthase,TS)基因的siRNA(Short interfering RNA)表达载体。方法:人工合成针对PCTS基因的1对shRNA(Short hairpin RNA)序列并定向克隆到空载体pTZU6+1上,构建siRNA表达重组质粒pPC-TS,并采用双酶切产物凝胶电泳和基因测序法鉴定。结果:酶切电泳和基因测序鉴定得到的产物与预期的目的基因一致。结论:成功构建卡氏肺孢子胸腺嘧啶核苷酸合酶基因siRNA表达载体。

肺腺癌细胞S100A6基因siRNA慢病毒载体构建及鉴定

目的:构建肺腺癌细胞S100A6基因siRNA慢病毒载体并鉴定。方法:慢病毒载体(pL enR-GPH)构建靶向S100A6基因的RNA干扰重组体,用以建立S100A6基因稳定沉默的肺腺癌A549细胞株。结果:PCR鉴定结果显示3个扩增的阳性片段均已插入pL enR-GPH载体,测序结果证实三个重组慢病毒载体SH1、SH2、SH3的插入序列完全正确,重组慢病毒载体转染到293T细胞中包装成病毒颗粒,将其感染肺癌A549细胞后,RT-PCR和Western blot检测结果均证实三组重组体感染的细胞内S100A6 mRNA和蛋白的表达受到不同程度的抑制,沉默效率分别为98.29%、84.05%及78.24%。结论:成功构建了S100A6基因RNAi慢病毒重组载体,并建立了其稳定表达的肺腺癌A549细胞株,为探讨S100A6基因对肺腺癌生物学行为的影响提供了可靠的细胞模型。

阴离子化高分子包覆非病毒载体提高有血清环境下RNA干扰效率的研究

大多数阳离子化高分子载体在血清环境中会大量吸附血清蛋白而导致转染效率低下,因而难以应用于临床。设计合成羧基化葡聚糖(Dex-COOH)和羧基化葡聚糖修饰富勒烯(C60-Dex-COOH)两种阴离子化高分子,并将其包覆在精胺化普鲁兰(Ps)与siRNA形成的复合物(PS/siRNA)外层,以减少复合物对血清蛋白的吸附。采用DLS/ELS检测阴离子包覆前后复合物的颗粒粒径及Zeta电位;用QCM-D验证阴离子包覆层的形成,并评价包覆层对牛血清白蛋白(BSA)吸附的影响;同时应用cck-8试剂、流式细胞术,检测包覆前后及不同包覆比例下复合物的细胞毒性、进入细胞的情况及对Hela-EGFP细胞的干扰效率。结果表明,Dex-COOH与C60-Dex-COOH能够在PS/siRNA外部形成稳定的负电性包覆层,有效阻止BSA的吸附,并在无血清的条件下显著降低复合物的细胞毒性;在有血清的环境中,表面包覆了阴离子化高分子的复合物可以不受血清蛋白的影响而被细胞大量摄取。对包覆了C60-Dex-COOH的PS/siRNA复合物转染组施加光照,可促使复合物从溶酶体中逃逸,将血清条件下PS/siRNA的干扰效率提高20%。该策略可有效提高阳离子化高分子载体介导的RNA干扰效率。

人TGF-β_2特异性siRNA质粒的构建

目的:构建人TGF-β2特异性siRNA质粒。方法:从NCBI中查找人TGF-β2的mRNA序列,并利用生物信息学对序列进行分析;根据siRNA的设计原则,选择最佳的siRNA序列;利用限制性内切酶BamHⅠ和BbsⅠ将相应的双链DNA插入到GPU6/GFP/Neo载体中;重组质粒经限制性内切酶BamHⅠ和PstⅠ单酶切进行鉴定,鉴定正确的质粒进一步通过基因测序的方法进行验证。结果:根据生物信息学选择TGF-β2mRNA的1016～1034区域作为干扰位点;重组质粒酶切结果表明双链DNA序列成功插入到了GPU6/GFP/Neo载体中;测序分析结果进一步证明插入序列与设计完全一致。结论:成功构建了人TGF-β2特异性siRNA干扰质粒,为研究TGF-β2基因功能和利用基因治疗的方法提高青光眼滤过手术成功率奠定了实验基础。

用于输送siRNA的聚乙烯亚胺-聚乙二醇二丙烯酸酯纳米凝胶

阐述了一种新的用于输送小干扰核糖核酸(siRNA)的聚乙烯亚胺-聚乙二醇二丙烯酸酯纳米凝胶的合成及其表征.在反相微乳液体系中,聚乙烯亚胺(PEI)和聚乙二醇二丙烯酸酯(PEG-DA)通过麦克尔加成交联得到纳米凝胶.1H-NMR和FTIR的结果充分证明纳米凝胶的化学结构,而动态光散射则表明纳米凝胶的颗粒粒径均匀,约为180 nm,zeta电位为37.9 mV.同时,MTT结果表明纳米凝胶在高达1 mg/mL的浓度下对MCF-7细胞也基本没有毒性.凝胶阻滞实验证明纳米凝胶在体外可以通过静电相互作用稳定结合siRNA.转染实验结果表明纳米凝胶与GFP siRNA的复合物能降低MCF-7 KMRV细胞(一种能稳定表达GFP蛋白的MCF-7细胞系)GFP蛋白的表达.以上结果证明这种生物相容性的纳米凝胶可以结合并输送siRNA进入细胞,沉默相关基因的表达.

Smad3基因小干扰RNA的序列设计及其表达载体的构建

目的构建大鼠Smad3基因小干扰RNA的表达质粒,为肝纤维化RNAi介导的基因治疗打下基础。方法利用互联网资源针对Smad3基因设计并合成三条可能的小干扰RNA,脂质体瞬时转染大鼠肝星状细胞,RT-PCR检测Smad3基因的表达情况。然后将这三条小干扰RNA插入到RNA干扰载体pRNAT-U6.1/Neo中,构建成三条干扰载体并测序。结果 RT-PCR和测序结果表明,成功构建了Smad3基因的RNA干扰真核表达载体。结论重组质粒pRNAT-SiSmad3的成功构建,为后续的Smad3基因下调实验提供了可能。