联合应用siRNA和拉米夫定抑制HBV复制和表达的实验研究

观察联合应用小干扰RNA和拉米夫定对HepG2.2.15细胞中HBV抗原表达和复制的抑制作用。构建并转染重组质粒psil-HBV到HepG2.2.15细胞中。转染后的细胞培养基中加入拉米夫定(0.05μm),分别于48、72、96 h收获细胞。用ELISA方法检测HBeAg和HBsAg;HBV DNA水平用实时定量PCR测定;用逆转录PCR检测HBV mRNA水平。96 h后联合应用小干扰RNA和拉米夫定组细胞培养上清中HBeAg和HBsAg抑制率分别为91.8%和82.4%(P<0.05);HBV mRNA表达水平明显降低。HepG2.2.15细胞中联合应用小干扰RNA和拉米夫定对HBV复制的抑制作用比单独应用siRNA或拉米夫定更有效。

人泡沫逆转录病毒介导的siRNA抑制HBV基因表达与复制

本研究采用基于PCR技术的siRNA表达方法,快速筛选到两个可以抑制HBV基因表达的siRNAs序列:S2和X1.S2和X1被克隆到人泡沫逆转录病毒(human foamy virus,HFV)载体中,构建成为分别表达S2和X1的单表达载体和同时表达S2和X1的双表达载体.将siRNAs表达载体转导入HepAD38细胞系中,多种检测分析的结果表明这些siRNA表达载体可以有效抑制多个HBV基因的表达和病毒DNA复制;并且其抑制作用是长期的,可以持续到转导后3个月.

HepG2.2.15细胞中联合应用siRNA抑制HBV复制和表达的研究

观察联合应用siRNA对HepG2.2.15细胞中HBV抗原表达和复制的抑制作用。应用ELISA方法检测HBeAg和HBsAg;HBV DNA水平用实时定量PCR测定;用RT-PCR检测HBV mRNA水平。结果显示,实验中应用的HBV特异性siRNA均具有明显的抗HBV抗原表达和病毒复制作用;联合应用siRNA较单独应用具有更强的抗HBV作用。可见,HepG2.2.15细胞中联合应用siRNA对HBV复制的抑制作用比单独应用siRNA更有效。

针对HBVS基因发夹状siRNAs表达载体的构建及其在HepG2215细胞中对HBV基因表达的抑制作用

目的探讨通过载体在体外培养的细胞中表达发夹状siRNAs对HBV基因表达的抑制作用。方法构建表达针对HBV S基因mRNA的发夹状siRNAs的质粒pSilencer 2.1-U6-S,并与ayw亚型HBV全基因组表达质粒共转染体外培养的HepG2215细胞,用半定量RT-PCR分析目标mRNA表达丰度的变化,用ELISA法观察HBsAg表达的变化。结果siRNA处理组细胞上清中HbsAg和HBeAg含量分别比空白对照组降低了63.4%和68.0%,细胞中的2.1kb的信使RNA降低了75.2%。结论siRNA在体外培养的细胞中能有效地抑制HBV基因的表达。

核酸内切酶制备的siRNA抑制HBV基因表达和复制

目的:研究核酸内切酶制备的siRNA(esiRNA)对HBV基因表达和复制的抑制作用。方法:利用分子生物学方法制备了分别针对HBV S基因和C基因的esiRNA(SesiRNA、CesiRNA),与HBV复制型质粒pHY106+wta共转染HepG2细胞,化学发光微粒免疫分析方法检测细胞培养上清中的HBsAg和HBeAg,Northern和Southern印迹检测HBV的mRNA和病毒复制中间体水平。结果:EsiRNA特异抑制HBV基因表达和复制,呈剂量依赖性。在工作浓度为100 nM时,SesiRNA和CesiRNA分别抑制细胞培养上清中75.96%和68.09%的HBsAg,79.69%和78.40%的HBeAg,降低细胞内60%和58%的HBV mRNA,抑制90%和87%的HBV病毒复制中间体。而且SeciR-NA对于多种HBsAg自然突变体的表达均有抑制作用。结论:EsiRNA可以有效抑制HBV的基因表达和病毒复制,尤其对于HBV的不同基因型/亚型和准种可以发挥广谱效应。

HBsAg ELISA+/HBV DNA NAT-献血者血清学与分子生物学特征分析

目的 了解西安地区无偿献血人群HBsAg ELISA检测结果与HBV DNA检测结果不一致的标本相关血清学标志物的分布情况。方法 收集2022年11月1日—2023年4月30日陕西省血液中心HBsAg ELISA+/HBV DNA NAT-(ELISA+/NAT-)标本共计71份,对其采用电化学发光法检测乙肝血清学标志物,同时复检巢式PCR扩增HBV S区和C区基因片段。结果 双ELISA+/NAT-标本(n=30)巢式PCR检测阳性率远高于单ELISA+/NAT-标本(n=41)(60%vs 24.40%,P<0.05)。前者献血者100%为初次献血者,血清抗-HBc阳性率100%,血清学模式以1、4、5此3项阳性(80%)为主;后者献血者中31.7%为重复献血者,血清抗-HBc阳性率仅为19.51%,血清学模式以单2项阳性(43.90%)和全阴(36.58%)为主。结论 单ELISA+结果存在较多假阳性,导致不必要的血液报废;而NAT-标本可能存在低水平的HBV DNA,产生漏检风险。建议针对单HBsAg ELISA+/NAT-献血者,采用多套系统多种方法追溯检测,提高献血者HBV筛查的准确度,减少不必要的血液浪费。

联合应用siRNA抑制HBVcccDNA的实验研究

RNA干扰是细胞利用21-23nt双链RNA介导的转录后同源mRNA沉默的现象[1]。由于具有高度特异性和有效性,RNA干扰被广泛用于HIV、HCV、流感病毒等功能性基因的研究中。基于逆转录环节在HBV复制中的重要作用,一些学者已经证实RNA干扰可以通过沉默病毒基因来抑制HBV复制[2,3],

Stealth siRNA对HBV复制和表达的抑制

目的设计siRNA并检测其对HBV的抑制作用。方法针对HBV基因组设计siRNA基因序列,化学修饰合成3种Stealth siRNA,转染带有HBV的2.2.15细胞,ELISA法检测其对HBV复制和表达的影响。结果3种Stealth siRNA对HBV的复制和表达在不同时间有不同程度的抑制作用。72 h后就可检测出抑制,其中siRNA508效果最显著。结论合成的Stealth siRNA可以抑制HBV的复制和表达,有望成为控制HBV感染的一种手段。

2016—2022年我国17家血液中心献血者HBV感染相关标记物检测情况分析

目的探讨我国17家省会城市血液中心(简称血液中心)献血者HBV的感染情况,为安全献血者管理提供参考。方法选取17家血液中心,收集2016—2022年献血者HBsAg和乙型肝炎病毒核酸(HBV DNA)检测结果,比较初次献血者和重复献血者HBsAg不合格率及年度变化趋势、初次献血者和重复献血者HBsAg不合格率差异、HBsAg合格献血者HBV DNA单独不合格(HBsAg-/HBV DNA+)情况和献血者总体HBV不合格率,比较不同地区血液中心献血者总体HBV不合格率。结果2016—2022年17家血液中心初次献血者HBsAg不合格率为59.60‱(1.60‱~142.85‱),重复献血者HBsAg不合格率为16.67‱(0.60‱~48.68‱),HBsAg合格献血者中HBV DNA单独不合格率为6.69‱(1.30‱~17.57‱),献血者总体HBV不合格率为47.06‱(3.46‱~103.78‱),上述4项不合格率的比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。东部地区献血者HBV总体不合格率(34.04‱)低于中部地区(50.42‱)和西部地区(52.07‱),3个地区献血者间差异均有统计学意义(P<0.05)。结论17个省会城市初次献血者和重复献血者的HBsAg不合格率随时间整体呈下降趋势,重复献血者是相对安全的献血人群,HBV DNA检测可进一步降低HBV经血传播的风险。献血人群HBV感染分布具有地域性,东部地区献血者HBV不合格率明显低于中西部地区,与一般人群HBV流行分布情况一致。

献血者HBVs基因变异的生物信息学分析

目的分析HBV DNA+/HBsAg-献血者的传染性指标、S区基因序列突变情况及生物信息学特征变化。方法通过PCR方法筛查出1份HBV DNA+/HBsAg-的标本,应用酶联免疫和化学发光方法检测该标本乙肝病毒5项指标,对该标本HBVs区基因片段测序并分析变异情况,应用分析软件对所测序列进行生物信息学分析。结果该标本HBV DNA+、HBsAg-、HBsAb+、HBeAg+、HBeAb-、HBcAb+;HBVs区基因序列内发生氨基酸单位点突变(P151L),空间结构发生改变。结论HBVs区基因序列空间结构改变,可能是导致检测结果出现血清学HBsAg-/HBsAb+/HBV DNA+的原因。

实时荧光定量RT-PCR技术检测siRNA对HBV复制的干扰效果

目的运用实时荧光定量RT-PCR的方法,检测小RNA分子(small interfering RNAs,siRNA)对乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)复制的抑制作用。方法在HepG2.2.15细胞内导入筛选的三条特异抗HBV的siRNA分子,用实时荧光定量RT-PCR的方法,检测干扰后HBV的mRNA表达水平。结果导入特异siRNA分子的细胞中HBV的mRNA表达量明显降低。结论实时荧光定量RT-PCR技术能准确可靠的检测mRNA的表达水平,对siRNA分子干扰效果的评价有很好的应用价值。

HBV C基因型有关的HBsAg阴性HBV DNA阳性患者S区突变对HBsAg的影响

目的通过构建HBV C基因型突变质粒研究HBsAg阴性HBV DNA阳性患者HBV S区突变对HBsAg水平的影响。方法收集2022年8月至2023年4月首都医科大学附属北京佑安医院107例HBsAg-/HBV DNA+患者血液样本,对成功提取扩增的HBV DNA S区进行测序,通过构建HBV C基因型突变质粒对HBV S区突变位点进行细胞功能验证,探讨OBI可能发生的分子机制。结果对成功提取扩增的68例患者进行测序,发现HBV S区存在大量突变,包括免疫逃逸突变(如sG145R、sK122R、sS114T、sT131P等)和跨膜结构域(transmembrane domain,TMD)突变(如sT5A、sG10D、sF20S等)。通过构建HBV C基因型突变质粒,进行细胞转染和细胞免疫荧光实验发现sG145R突变会明显降低HBsAg的表达,但是sK122R、sI26N、sQ29N、sR169H、sS114T、sT131P这6个突变位点并未影响细胞内外HBsAg的表达。结论通过测序发现HBsAg-/HBV DNA+患者HBV S区存在大量突变位点,通过构建sG145R、sK122R、sI26N、sQ29N、sS114T和ST131P等突变质粒发现sG145R突变会明显降低细胞内外HBsAg的表达,但是sK122R、sI26N、sQ29N、sR169H、sS114T、sT131P并未明显降低细胞内外HBsAg的表达。

siRNA抗HBV感染领域中的化学修饰和体内传递研究进展

世界人口中约有3.5亿感染乙肝病毒,乙肝病毒感染是急慢性肝炎的主要原因,其与肝纤维化和肝细胞癌的发生密切相关。目前的治疗药物不良反应多或易产生耐药性,因此迫切需要找到新的治疗手段。本文依据近5年来国内外文献进行分析、归纳、总结,综述了治疗HBV感染的小干扰RNA(small RNA interference,siRNA)药物在化学修饰和体内传递方面新进展。RNAi途径可实现病毒基因转录后沉默,特异性和有效性地抑制HBV基因的表达和复制,是治疗HBV感染的一种新颖而有效的途径。而小干扰RNA(siRNA)的化学修饰和体内传递研究,可提高其在体内的稳定性和靶向性。

IL-18评价人工肝治疗HBV相关慢加急性肝衰竭有效性及短期预后效果的研究

目的探讨血清白细胞介素-18(IL-18)评价人工肝治疗乙型肝炎病毒(HBV)相关慢加急性肝衰竭(HBV-ACLF)的有效性及短期预后效果。方法选取2022年1月—11月于我院接受治疗的HBV-ACLF患者151例,所有患者均成功接受人工肝治疗,根据患者90 d内结局分为死亡组(n=63)和生存组(n=88),另选择73例健康受试者作为对照(健康组)。检测患者入院时、治疗后及健康受试者血清IL-18水平,分析IL-18水平对患者预后的评估价值。结果HBV-ACLF患者入院时及治疗后血清IL-18均显著高于健康组,死亡组患者入院时及治疗后血清IL-18均显著高于生存组(P<0.05)。Spearman相关性分析显示IL-18与终末期肝病模型(MELD)呈正相关。多因素Cox回归分析显示,血清IL-18水平是HBV-ACLF患者人工肝治疗后死亡的独立危险因素(P<0.05)。受试者工作曲线(ROC)显示患者入院时、治疗后血清IL-18水平诊断HBV-ACLF患者人工肝治疗后90 d死亡率的曲线下面积分别为0.760、0.739。Kaplan-Meier曲线显示,低IL-18水平患者的生存率高于高IL-18水平患者(P<0.05)。结论血清IL-18可辅助评价HBV-ACLF患者人工肝治疗效果及治疗后短期预后。

HBV pgRNA联合HBcrAg对慢性乙型肝炎患者停药后复发的预测价值

目的分析乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)前基因组RNA(pregenomic RNA,pgRNA)水平联合HBV核心相关抗原(hepatitis B virus core-related antigen,HBcrAg)定量对慢性乙型肝炎(chronic viral hepatitis B,CHB)患者停药后复发风险的预测价值。方法选取中国人民解放军联勤保障部队第926医院2020年6月至2021年6月收治的113例CHB患者为研究对象,所有患者均已给予足疗程的正规抗病毒治疗,停药前均检测批pgRNA与HBcrAg。根据患者停药1年内复发情况分为复发组(38例)和未复发组(70例),比较两组患者的一般资料、肝功能、肾功能、甲胎蛋白(alphafetoprotein,AFP)、pgRNA及HBcAg水平等指标。应用多因素Logistic回归分析CHB患者停药后复发的影响因素。应用受试者工作特征(receiver operator characteristic,ROC)曲线分析pgRNA联合HBcrAg对CHB患者停药后复发风险的预测价值。结果复发组患者饮酒史比例[47.37%(18/38)比22.86%(16/70)]、AFP[(29.64±7.18)μg/L比(20.38±6.46)μg/L]、pgRNA[(7.97±1.99)lg拷贝/ml比(4.97±1.24)lg拷贝/ml]和HBcrAg[(7.04±1.76)lg IU/ml比(5.11±1.28)lg IU/ml]水平均显著高于未复发组(P均<0.05)。多因素Logistic回归分析表明,饮酒史(OR=5.354,95%CI:1.055~68.858,P=0.046)、AFP(OR=1.189,95%CI:1.036~1.468,P=0.015)、pgRNA(OR=1.047,95%CI:1.117~8.109,P=0.007)和HBcrAg(OR=2.152,95%CI:1.154~4.308,P=0.021)是CHB患者停药后复发的独立危险因素。pgRNA与HBcrAg联合预测CHB患者停药后复发的ROC曲线下面积为0.954,最佳截点为>0.128,此时敏感度为98.9%,特异度为97.1%。结论pgRNA和HBcrAg与CHB患者停药后复发风险密切相关,早期监测两者水平有助于发现停药后复发高风险的患者,早期调整治疗方案。

妊娠合并慢性乙型肝炎血清HBV pgRNA、PreS1抗原表达与肝内胆汁淤积症的相关性分析

目的 探究妊娠合并慢性乙型肝炎病人血清乙型肝炎病毒(HBV)前基因组RNA(HBV pgRNA)、前S1抗原(PreS1Ag)水平变化及与妊娠期肝内胆汁淤积症(ICP)发生的相关性。方法 选取2017年6月至2020年6月在雅安市人民医院进行孕期检查的慢性乙型肝炎孕妇279例作为研究对象,根据入组病人是否患有ICP分为合并ICP组43例、未合并ICP组236例。比较两组病人血清中HBV pgRNA、PreS1 Ag水平,并分析两组血清HBV pgRNA、PreS1 Ag表达与HBV DNA表达水平相关性;比较两组病人妊娠结局,并分析合并ICP组病人血清HBV pgRNA表达水平及PreS1 Ag阳性表达率与妊娠结局的关系。受试者操作特征(ROC)曲线分析血清HBV pgRNA、PreS1 Ag光密度[D(λ)]值诊断慢性乙型肝炎孕妇合并ICP的效能。结果 合并ICP组慢性乙型肝炎病人血清HBV表面抗原(HbsAg)水平[(3.71±0.92)log IU/mL]、HBV e抗原(HbeAg)阳性率[65.12%(28/43)]、HBV DNA含量[(8.03±1.69)log copies/mL]、天冬氨酸转氨酶(AST)[(79.68±15.73)U/L]、丙氨酸转氨酶(ALT)[(72.08±16.95)U/L]、PreS1 Ag阳性表达率[88.37%(38/43)]、PreS1 Ag D(λ)值水平(1.24±0.25)及HBV pgRNA表达水平[(5.17±1.25)log copies/mL]明显高于未合并ICP组[(2.26±0.74)log IU/mL、24.15%(57/236)、(5.19±1.07)logcopies/mL、(23.01±12.47)U/L、(21.76±10.51)U/L、67.80%(160/236)、(0.92±0.23)、(3.02±0.98)logcopies/mL](P<0.05)。血清HBV pgRNA诊断慢性乙型肝炎孕妇合并ICP的曲线下面积(AUC)为0.89,灵敏度为81.40%,特异度为80.50%。PreS1 Ag D(λ)值诊断慢性乙型肝炎孕妇合并ICP的AUC为0.83,灵敏度为76.70%,特异度为79.20%。二者联合诊断的AUC为0.91,灵敏度为93.00%,特异度为78.40%。合并ICP组、未合并ICP组血清PreS1 Ag阳性的慢性乙型肝炎病人血清HBV DNA、HBV pgRNA表达水平均明显高于PreS1 Ag阴性表达病人(P<0.05)。合并ICP组、未合并ICP组血清HBV pgRNA、PreS1 Ag D(λ)值均与HBV DNA表达水平呈正相关(P<0.05)。合并ICP组产后出血、早产的发生率明显高于未合并ICP组(P<0.05)。发生不良妊娠结局的慢性乙型肝炎合并ICP病人血清PreS1 Ag阳性表达率、PreS1 Ag D(λ)值、HBV pgRNA表达水平均明显高于未发生不良妊娠结局病人(P<0.05)。结论 合并ICP的慢性乙型肝炎病人血清HBV pgRNA表达水平、PreS1 Ag阳性表达率及D(λ)值水平均明显升高,对ICP有一定诊断价值,且两者水平变化均与HBV DNA含量有关,并可能预示病人不良妊娠结局的发生。

92031例癌症患者HBV血清标志物特征分析

目的了解癌症患者乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的感染状态和感染特点。方法回顾性分析2017年7月26日至2023年9月18日于广西医科大学附属肿瘤医院确诊的92031例癌症患者的HBV血清标志物检测结果,以肝癌、非肝癌进行分组,比较未感染(全阴或Anti-HBs阳性)、感染(除外Anti-HBs任何一项阳性)、隐性感染(occult hepatitis B virus infection,OBI;HBsAg阴性、血清或肝组织HBV DNA阳性)的占比。结果92031例癌症患者的HBV总感染率为73.75%(67876/92031),其中肝癌患者的HBV总感染率为97.65%(8922/9137),非肝癌患者的HBV总感染率为71.12%(58954/82894),肝癌组的普通感染率和OBI率均显著高于非肝癌组(均P<0.001)。肝癌组HBV血清标志物中HBsAg、HBeAg、Anti-HBe、Anti-HBc的阳性率明显高于非肝癌组(均P<0.001),但Anti-HBs的阳性率低于非肝癌组(P<0.001)。肝癌组和非肝癌组分别有20种和27种血清标志物组合模式,其中14种模式构成比在两组间差异有统计学意义(均P<0.001);两组均有7种OBI血清组合模式,其中5种模式构成比在两组间的差异有统计学意义(均P<0.05)。结论癌症患者HBV感染状态和血清学组合模式复杂,区分肝癌与非肝癌进行HBV感染统计更利于癌症患者的HBV感染评估。

基于HBV感染的确认探讨核酸检测反应性献血者的归队策略

目的基于血液筛查核酸检测反应性献血者的HBV感染的确认,探讨核酸检测反应性献血者的归队策略。方法联合应用自建的高灵敏度核酸检测体系、血液核酸筛查等多种核酸检测(NAT)方法,并结合血清学检测、献血者随访,对核酸检测反应性(NAT-yield)献血者中的HBV感染进行确认和感染状态识别。依据确认的HBV感染血浆样本,比较不同确认方法、确认指标或指标组合对HBV感染确认的效果。结果2010年11月—2021年2月,在血液筛查检出的876位NAT-yield献血者中共确认HBV感染者511人(OBI 451人,急性早期HBV感染者27人,不能确认感染者33人,无感染者30人,不能确认HBV感染者335人)。采用单检系统对混检系统检出的HBV感染血浆进行复测的检出率为96.6%,明显高于混检系统对单检系统检出的HBV DNA反应性(HBV DNA R)组和鉴别试验无反应性(NDR)组的复测检出率(76.4%和55.7%)(P<0.05)。NDR样本在模式2(ID×5+鉴别×2)下复测检出率(65.2%)高于模式1(ID×2+鉴别×1)(39.2%)(P<0.05);2种单检复测模式下的HBV DNA R样本复测检出率无明显差异(P>0.05),但均明显高于NDR样本(P<0.05)。回溯OBI献血者既往NAT数据,有46%经历多次NAT检测而未能检出。有59.1%OBI献血者随访检不出HBV DNA。OBI献血者中抗-HBc+占比为90.2%,单独抗-HBc+为49.2%,远高于不能确认感染组(P<0.05);HBeAg、抗-HBe和抗-HBc IgM在OBI和不能确认感染组中的比例极低且无差异(P>0.05)。结论近60%的NAT-yield献血者可以确认HBV感染。为保证献血者归队的安全性,需要更高灵敏度的HBV DNA确证技术提高HBV感染的确认率。抗-HBc是NAT-yield献血者OBI风险排查和归队评估最重要的血清学指标。

癌胚性TUFT1异常表达与HBV相关肝细胞癌的研究进展

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的预防、早期诊断及精准治疗仍是亟需攻克的难题。肝炎病毒(HBV or HCV)慢性持续性感染、化学致癌物摄入和非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)等与HCC进展密切相关。最新发现,在牙釉质发育和矿化中起重要作用的釉丛蛋白(Tuftelin,TUFT1)异常转录,在人体组织中广泛分布。TUFT1作为酸性、磷酸化糖蛋白可促进肿瘤进展与转移。然而,TUFT1表达与HCC的研究报道尚不多见。本文综述了TUFT1基因结构、组织分布与肿瘤的关系,重点分析其在HBV-HCC进展中作用及其应用前景。

一例HBV再激活后血清HBsAg阴性HBeAg阳性的病例分析

回顾性分析一例HBV再激活后血清HBsAg阴性HBeAg阳性的病例。通过分析其诊断过程,以加强检验对HBV再激活的认识。为HBV再激活的发生机制和诊治的探讨提供一定依据。