siat7e基因和st3gal Ⅰ基因双表达载体的构建及其初步应用

应用聚合酶链式反应(PCR)技术,从人类基因组中扩增出全长为1011 bp的唾液酸转移酶(siat7e基因),并从鸡基因组中扩增出全长为1029 bp的β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶Ⅰ(ST3GAL Ⅰ)基因。将它们分别克隆入pMD18-T载体中。对扩增的全长siat7e基因序列采用BamH Ⅰ和PstⅠ双酶切后连接入pReceiver真核表达载体,构建pRE-SⅠAT重组表达载体,进而,对扩增的全长st3gal Ⅰ基因采用Sac Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切,后连接入pRE-SIAT重组表达载体,构建pRE-SIAT-ST3重组真核表达载体。经限制性内切酶消化及DNA序列分析,证实构建的重组表达质粒是正确的。将构建的双基因表达载体转染MDCK细胞,利用荧光显微镜观察,可见细胞表达明显的绿色荧光,从而初步证实了外源基因在MDCK细胞中的正确表达。本研究为最终构建能够适应悬浮培养,并且对禽流感病毒更为易感的MDCK细胞系奠定了基础。

转染siat7e基因的MDCK细胞悬浮性状分析与质控

目的分析转染siat7e基因的MDCK细胞(MDCK-siat7e)的悬浮特性,并建立相关质控方法。方法将MDCKsiat7e细胞接种无血清培养基BD001,37℃,130 r/min振摇培养11 d,显微镜观察不同培养时间细胞形态,并检测细胞生长浓度、活力及代谢状况。提取MDCK-siat7e细胞的m RNA,采用RT-PCR法扩增siat7e基因片段并测序。通过Real time PCR法检测不同代次(原代、10、20、30代)MDCK-siat7e细胞siat7e基因的表达量。结果 MDCK-siat7e细胞在无血清培养基中呈悬浮生长状态,细胞接种培养初期生长较慢,但活力较好;然后细胞生长经停滞期进入生长期,细胞生长加快且活力大于98%,细胞浓度达峰点后生长进入平台期;培养后期细胞浓度降低且活力下降。原代与传代细胞siat7e基因序列测定结果与Gen Bank公布的ST6Gal Nac V序列(AJ507292.1)一致。MDCK-siat7e细胞传至30代,仍可表达siat7e,表明外源siat7e基因整合入MDCK细胞基因组中,并随MDCK细胞传代持续地转录和表达。结论本实验对siat7e基因的定性及表达量的分析可用于MDCK-siat7e细胞悬浮性的检测,为其作为疫苗用细胞基质的质量监控提供了依据。

共表达siat7e和st3galⅠ基因MDCK细胞株的建立

为建立易悬浮驯化和对流感病毒易感的MDCK细胞株,将表达siat7e和st3galⅠ基因的真核表达载体电击转染MDCK细胞,采用有限稀释法、荧光定量PCR和流式细胞术成功筛选到1株双基因共表达MDCK-C5细胞株,且传至12代后仍表达稳定,为流感疫苗工业化大规模生产奠定了基础。