降钙素基因相关肽对血管内膜损伤后内皮细胞功能恢复的影响

在球囊剥脱大鼠主动脉内膜造成的内皮损伤模型上，用ＣＧＲＰ（１０μｇ／ｋｇ／ｄ）治疗后观察血管内皮合成释放ｖＷＦ含量及ｔ－ＰＡ活性的变化。结果表明ＣＧＲＰ能明显降低ｖＷＦ含量和增加ｔ－ＰＡ活性。提示ＣＧＲＰ能减轻内皮损伤反应。

蝎毒纤溶活性肽对血管内皮细胞分泌纤溶因子的影响

目的 研究蝎毒纤溶活性肽 (SVFAP)对血管内皮细胞释放组织型纤溶酶原激活剂 (t -PA)和纤溶酶原激活剂抑制物 (PAI - 1)的影响。方法 将不同浓度SVFAP与脐静脉内皮细胞共同孵育 10min及 4h后 ,分别收集培养液 ,以发色底物法测定培养液中t-PA和PAI -1的活性。结果 SVFAP在用药后 10min及 4h各浓度大多使t-PA活性增强 ,PAI - 1活性降低 ,t-PA/PAI - 1比值升高。结论 SVFAP的纤溶作用与抑制内皮细胞分泌PAI - 1和促进t-PA释放有关。

人组织型纤溶酶原激活剂突变体微小基因的构建

tPA基因全长约 36kb ,至少由 13个内含子分隔为 14个外显子。根据tPA的第一、二外显子的编码情况 ,考虑建立从第二至第六外显子序列在内的tPA微小基因。

急性心肌梗死大鼠血管紧张素Ⅱ对PAI-1和tPA表达的作用及其机制

目的:探讨急性心肌梗死(AMI)大鼠血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)经AngⅡ1型受体(AT1R)激活细胞外信号调节激酶(ERK)对纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)和组织型纤溶酶原激活物(tPA)活性的调节作用。方法:24只健康SD大鼠,按随机数字表法随机分为假手术组(n=8)、AMI组(n=8)和特异性ERK上游激酶抑制剂(PD98059)组(n=8),用结扎左冠状动脉前降支方法制作大鼠AMI模型,建模后14d,制备心肌组织切片观察心肌组织病理学改变;放射免疫法检测大鼠血浆和主动脉组织匀浆AngⅡ含量;发色底物法检测血浆和主动脉孵育液PAI-1和tPA活性;Western blotting分析法检测主动脉组织匀浆磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)和ATlR蛋白表达水平。结果:①假手术组心肌纤维排列整齐,核规则;AMI组心肌纤维消失中断,部分心肌细胞空泡变,部分心肌纤维及核溶解消失,肌纤维呈空管状,梗死区为大量纤维结缔组织取代并有炎症细胞浸润;PD98059组AMI的病理改变明显减轻。②与假手术组比较,AMI组血浆和主动脉组织匀浆AngⅡ含量及血浆和主动脉孵育液PAI-1活性均显著增高(P<0.05),但血浆和主动脉孵育液tPA活性及其tPA/PAI-1比值均明显降低(P<0.05)。③与假手术组比较,AMI组主动脉组织匀浆p-ERK1/2和ATlR蛋白表达水平均显著增高(P<0.05或P<0.01)。④各组大鼠血浆和主动脉组织匀浆AngⅡ含量、血浆和主动脉孵育液PAI-1活性及主动脉组织匀浆p-ERK1/2和ATlR蛋白表达水平之间呈正相关关系(r=0.85～0.94,P<0.01)。⑤与AMI组比较,PD98059组血浆和主动脉组织匀浆AngⅡ含量、血浆和主动脉孵育液PAI-1活性、主动脉组织匀浆p-ERK1/2和ATlR蛋白表达均显著降低(P<0.05),但血浆和主动脉孵育液tPA活性及其tPA/PAI-1比值均明显增高(P<0.05)。结论:AMI时AngⅡ具有诱导PAI-1但抑制tPA合成与分泌的作用,其机制可能与AngⅡ经AT1R激活ERK有关。

厄贝沙坦对高血压患者纤溶活性内皮素一氧化氮降钙素基因相关肽的影响

目的 观察厄贝沙坦治疗原发性高血压(EH)时对纤溶活性、内皮素(ET)、一氧化氮(NO)、降钙素基因相关肽(CGRP)的影响。方法 6 2例健康体检者作为正常对照组,6 8例EH患者用厄贝沙坦治疗8周,观察用药前后血压、血浆组织型纤溶酶原激活物(t -PA)及其抑制物(PAI)活性及内皮素、一氧化氮、降钙素基因相关肽浓度的变化。结果 EH患者t PA活性、CGRP和NO浓度明显低于正常对照组(P <0 .0 1) ;而PAI活性、ET浓度明显高于正常对照组(P <0 .0 1) ,厄贝沙坦治疗后,血压显著低于治疗前(P <0 .0 1) ,血t -PA活性、NO、CGRP浓度均较治疗前显著升高(P <0 .0 1) ;血ET浓度显著下降(P <0 .0 1)。结论 EH患者存在纤溶活性和内皮功能异常;厄贝沙坦可改善EH患者纤溶活性和内皮功能。

血清脑钠肽 脂肪因子趋化素与rt-PA静脉溶栓脑梗死患者预后的相关性分析

目的探讨血清脑钠肽(BNP)、脂肪因子趋化素(Chemerin)与重组组织型纤溶酶原激活物(rt-PA)静脉溶栓脑梗死患者预后的相关性。方法选取河南科技大学第一附属医院2014-07—2019-03采用rt-PA静脉溶栓治疗的脑梗死患者90例,溶栓治疗后随访90 d,采用Rankin量表(mRS)评估患者预后,将mRS≤2分定义为功能结局预后良好组,将mRS>2分患者定义为预后不良组,比较2组血清BNP、Chemerin水平,通过Pearson相关性分析血清BNP、Chemerin与mRS评分的相关性,分析rt-PA静脉溶栓患者预后的影响因素。结果90例患者随访90 d,预后良好者58例,预后不良者32例,预后良好组血清BNP、Chemerin含量低于预后不良组(P<0.05);Logisitic回归分析显示,年龄、颈部大血管狭窄≥50%、OSCP分型、溶栓前NIHSS评分、OTT时间、BNP含量、Chemerin含量是影响脑梗死rt-PA静脉溶栓患者预后的独立危险因素;Pearson相关性分析显示,血清BNP、Chemerin水平与mRS评分呈正相关(r=0.345、0.364,P<0.05);血清BNP、Chemerin联合检测预测患者预后状态ROC曲线下面积为0.860,高于单独BNP、Chemerin判断曲线下面积0.758、0.760(P<0.05)。结论血清BNP、Chemerin是rt-PA静脉溶栓脑梗死患者预后的影响因素,与患者mRS评分呈正相关,可作为患者预后的辅助评估指标。

组织型纤溶酶原激活剂（t－PA）cDNA序列的测定

已经从ｍｅｌａｎｏｍａ细胞系中成功地获得了人组织型纤溶酶原激活剂（ｔ－ＰＡ）ｃＤＮＡ，在此基础上用双脱氧终止法测定了ｔ－ＰＡｃＤＮＡ编码区全序列及３′非编码区部分序列，并发现与Ｐｅｎｎｉｃａ等发表的ｔ－ＰＡｃＤＮＡ序列相比，有两处差异，其一是第１７２５位核苷酸残基为Ｃ而非Ａ，并使此处序列与Ｐｅｎｎｉｃａ序列相比新产生一个ＳｔｙＩ切点，但由于差异发生在密码子第三位，没有引起编码的氨基酸变化；其二是第１７７７位核苷酸残基（终止密码子后第４位核苷酸残基）为Ｔ而非Ｇ，使与终止密码子相隔３个核苷酸残基处产生了一个新的ＴＧＡ，与Ｐｅｎｎｉｃａ序列相比此处的ＢｓｔＮＩ切点也消失了。

神经源性丝氨酸蛋白酶抑制剂对大鼠小胶质细胞丝裂原活化蛋白激酶和核转录因子-κB信号通路的作用

目的观察小胶质细胞(MG)在缺氧、缺糖(OGD)模型或组织型纤溶酶原激活剂(tPA)干预下被激活的主要信号通路,探讨神经源性丝氨酸蛋白酶抑制剂(NSP)抑制MG进而产生神经保护作用的可能机制。方法体外原代培养大鼠皮层MG并鉴定,建立OGD模型。将MG随机分为正常组、tPA组(经终浓度为0.05μg/μL的tPA干预24h)、OGD 3h组(经OGD模型干预3h)、NSP+tPA组(经终浓度为0.025μg/μL的NSP预处理0.5h后,再以终浓度为0.05μg/μL的tPA干预24h)和NSP+OGD 3h组(经终浓度为0.025μg/μL的NSP预处理0.5h后,再经OGD模型干预3h)。采用免疫荧光双标染色法检测各干预组丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路磷酸化蛋白的表达情况和核转录因子(NF)-κB的核移位情况。采用免疫印迹法检测各组MAPK通路磷酸化蛋白表达量的变化。结果 MG纯度鉴定结果显示纯度>95%,OGD模型建立成功。免疫组织化学法检测结果显示,MAPK途径的磷酸化细胞外信号调节激酶(pERK)1/2、磷酸化p38(pp38)在正常组MG均有少量表达,且在tPA组和OGD 3h组的表达均显著升高;MAPK途径的磷酸化c-Jun氨基末端激酶(pJNK)在正常组MG有表达,但在tPA组和OGD 3h组的表达无明显变化。Western免疫印迹法检测结果显示,干预组(tPA组和OGD 3h组)pERK1/2、pp38和pJNK的表达量均较正常组显著升高(P值均<0.05)。NSP预处理组(NSP+tPA组和NSP+OGD 3h组)pERK1/2、pp38和pJNK的表达量均较干预组显著降低(P值均<0.05)。免疫荧光双标染色法检测结果显示,正常组MG中可见NF-κB(P65)蛋白主要表达于细胞质,细胞胞突显示清晰。tPA组和OGD 3h组MG中NF-κB发生明显的核移位现象,主要表达于细胞核,且细胞缺少胞突。NSP+tPA组和NSP+OGD 3h组MG中NF-κB的核移位现象明显减轻。结论大鼠肉瘤(Ras)/细胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun-氨基末端激酶(JNK)/应激活化蛋白激酶(SAPK)和p38通路对于MG在tPA和OGD干预下的激活均起作用,其中ERK1/2和p38发挥更重要的作用。tPA和OGD干预MG后,NF-κB发生明显的核移位,此通路被激活,经NSP预处理后,各条信号通路均被不同程度抑制。

血浆外泌体携带非编码RNA影响精神分裂症小鼠叶皮层锥体神经元突触活动的作用机制

目的通过全转录组测序技术揭示血浆外泌体miRNAs参与精神分裂症发生和发展的可能分子机制。方法获取精神分裂症小鼠和正常小鼠前额皮质组织和血浆外泌体进行全转录组测序筛选差异表达的m RNAs和miRNAs。从GEO数据库下载精神分裂症小鼠相关转录组测序数据集GSE111708、GSE108925和GSE189821,筛选差异表达的mRNAs。对差异基因进行GO功能和KEGG通路富集分析,随后对血浆外泌体中差异表达的miRNAs与小鼠前额皮质组织中差异表达的miRNAs取交集,通过TargetScan数据库检索miR-146a-5p下游靶基因,并使用Cytoscape v3.6.0软件对miRNAs-靶基因调控网络进行可视化和映射。结果全转录组测序数据差异分析共获得1549个差异基因,这些差异基因主要在突触调节相关功能和通路上富集。进一步对精神分裂症小鼠相关GEO芯片中的差异基因进行KEGG富集分析发现,精神分裂症相关基因与神经元退化相关。对精神分裂症小鼠前额皮质组织中的164个差异表达miRNAs与血浆外泌体中的5个差异表达miRNAs取交集,得到目标基因miR-146a-5p,且miR-146a-5p在前额皮质组织和血浆来源外泌体中均为高表达。最后对miR-146a-5p的161个靶基因与精神分裂症小鼠前额皮质组织中低表达的差异基因取交集发现,共11个靶基因在精神分裂症小鼠前额皮质组织中低表达,且这些基因富集在Notch信号通路上,主要参与调控神经元突触活动。结论血浆来源外泌体中的miR-146a-5p可能通过传递至叶皮层锥体神经元中靶向调控Notch1,进而抑制Notch信号通路介导的小鼠叶皮层锥体神经元突触活动,最终促进小鼠精神分裂症的发生和发展。

t-PA cDNA基因的克隆及测序

从基因工程菌株里氏木霉中提取基因组DNA,根据t-PAcDNA序列设计一对引物,利用PCR法扩增目的基因,将其与pMD18-T-Vector连接后转入大肠杆菌,通过Amp抗性和蓝白斑筛选出重组菌株,PCR法和双酶切法鉴定后再进行测序鉴定,测序结果表明:克隆的t-PAcDNA的第34位、450位和521位基因发生了突变。

CD137、ALP及血栓前状态分子对冠心病患者PCI后预后预测价值

目的探讨CD137、碱性磷酸酶(ALP)及血栓前状态分子对冠心病患者经皮冠状动脉介入(PCI)后预后预测价值。方法选取2019年8月—2021年3月收治的行PCI治疗的冠心病91例,根据心功能分级将其分为Ⅱ级组(28例)、Ⅲ级组(41例)和Ⅳ级组(22例)3组;术后随访1年,根据是否发生心血管不良事件将其分为预后良好组(64例)和预后不良组(27例)2组。比较不同心功能分级及预后冠心病患者CD137、ALP、促生长激素释放肽(Ghrelin)、血栓前状态分子,探讨CD137、ALP、Ghrelin及血栓前状态分子对冠心病患者PCI后预后预测价值。结果冠心病患者随着心功能分级增高,CD137、ALP和血栓前体蛋白(TpP)、血管性血友病因子(vWF)逐渐升高,Ghrelin和组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)逐渐降低(P<0.05)。预后良好组CD137、ALP和TpP、vWF低于预后不良组,Ghrelin和t-PA高于预后不良组(P<0.01)。CD137、ALP、Ghrelin和TpP、t-PA、vWF对冠心病患者PCI后预后预测价值的曲线下面积分别为0.799、0.719、0.793、0.825、0.742、0.964。结论CD137、ALP、Ghrelin及血栓前状态分子与冠心病患者心功能分级存在相关性,且上述指标检测对冠心病患者PCI后预后有一定预测价值。

尤瑞克林在组织型纤维蛋白酶原激活剂静脉溶栓治疗急性脑梗死中的应用

目的初步评价尤瑞克林在重组组织型纤维蛋白酶原激活剂（rt-PA）静脉溶栓治疗急性缺血性脑梗死中的安全性和有效性。方法采用随机、对照研究方法，入选患者按1：1随机分为对照组和试验组。对照组22例，仅给予rt-PA（0．9mg／kg）；试验组22例，rt-PA（0．9mg／kg）溶栓后静脉滴注尤瑞克林（0．15 PNAu／d，连续7d）。主要安全性评价指标是溶栓24h内症状性脑出血发生率，次要评价指标为患者神经功能缺损评分（NIHSS）、日常生活活动能力评分（BI）。结果溶栓24h内，试验组与对照组比较，脑出血率差异无统计学意义（4．6％对9．1％，X^2=0．00，P〉0．05），再梗死率有降低趋势（18．2％对31．8％，X^2=1．091，P〉0．05）。溶栓治疗后1d、21d和90d，试验组NIHSS评分显著低于对照组（t值分别为2．119、2．913、2．187，均P〈0．05）；试验组90dBI评分显著高于对照组（t=2．39，P〈0．05）。结论在不增加出血风险的情况下，尤瑞克林提高rt-PA静脉溶栓治疗急性脑梗死的疗效。

外源性组织型纤溶酶原激活物信号肽突变体增强蛋白质在哺乳细胞中的表达及分泌

目的 比较不同tPA信号肽突变体对目的蛋白表达和分泌水平的影响,优化并筛选通用性外源信号肽序列.方法 通过定点突变技术将人类组织型纤溶酶原激活物（tPA）的信号肽第22位氨基酸由脯氨酸（P）突变为丙氨酸（tPA22P/A）或甘氨酸（tPA22P/G）,并将突变前后的3种信号肽序列分别插入HIV-1 p24基因的N末端,构建不同的p24蛋白表达载体,这些重组表达载体体外瞬时转染人胚肾HEK293T细胞,转染72 h后,通过SDS-PAGE与western blot检测并比较各组培养上清和细胞中p24蛋白的表达水平.结果 成功构建了3个p24蛋白的真核表达载体P24T.tPA、P24T.tPA22P/A和P24T.tPA22P/G,经序列测定证实基因序列和方向与预期相符;重组载体转染293T细胞72 h后均检测到分泌性p24的表达.与P24T.tPA组相比,P24T.tPA22P/A转染组培养上清中和细胞内p24蛋白表达水平分别提高62%和29%,P24T.tPA22P/G转染组分别提高8%和6%.结论 tPA信号肽22位由脯氨酸突变为丙氨酸或甘氨酸,这就提高了目的蛋白的表达和分泌水平,为优化外源蛋白在哺乳细胞中的表达和分泌提供了实验基础.

组织型纤溶酶原激活剂在部分中枢神经系统中的作用

组织型纤溶酶原激活剂(tPA)的溶栓作用已被人们所熟知。近年研究发现tPA不仅是一种溶栓药,tPA的作用还具有:①通过多种途径参与突触调节、突触重塑(包括长程增强效应);②上调基质金属蛋白酶-9的表达,参与血脑屏障的破坏、水肿形成、出血性转化,也能促进血管重构、血管发生、神经发生和轴突再生;③通过细胞外信号调节激酶途径参与了阿尔茨海默病的病理过程。本文重点讨论tPA在中枢神经系统中所发挥的多元化作用。

日本乙型脑炎病毒PrMΔE与tPA信号肽融合基因DNA疫苗的研究

采用RT-PCR和重叠PCR方法分别扩增出日本乙型脑炎病毒PrMΔE基因和tPA信号肽序列,并将其插入载体pVAX1,将纯化后的重组质粒转染COS-7细胞,用间接免疫荧光法检测质粒在细胞中的瞬时表达情况,并用制备的质粒免疫昆明小鼠,检测其特异性血清IgG抗体水平、促脾淋巴细胞增长率及攻毒保护率。结果显示,真核表达质粒pVAX-tPA-PrMΔE构建成功;间接免疫荧光试验显示,该质粒在COS-7细胞中的表达产物可与鼠抗日本乙型脑炎病毒单克隆抗体发生特异性反应,tPA信号肽序列能明显增强PrMΔE基因DNA疫苗的免疫原性,显著提高小鼠的体液免疫和细胞免疫水平,能强有力地抵抗强毒株CZ-1的攻击。结果表明,成功构建了日本乙型脑炎病毒PrMΔE基因与tPA信号肽序列融合基因DNA疫苗(pVAX-tPA-PrMΔE),为日本乙型脑炎病毒基因工程疫苗的进一步研究及应用奠定了基础。