转天山雪莲sikPIP_3基因烟草的获得及抗逆性鉴定

利用PCR技术从实验室建立的天山雪莲DNA文库中克隆了天山雪莲质膜水孔蛋白基因sikPIP3,构建了植物表达载体pBI121-sikPIP3,通过农杆菌介导法转化烟草品种NC89,经PCR和RT-PCR检测证明目的基因成功导入并得到了表达,采用水分胁迫进行抗旱分析和采用冷冻胁迫进行抗寒性分析。结果显示:(1)克隆出具有水孔蛋白基因特性的sikPIP3基因。(2)经断水干旱处理,转基因烟草的生长表型优于野生型烟草,特别是在断水9d的情况下,野生型烟草已经完全萎蔫,转基因烟草萎蔫症状较轻;生理指标测量结果显示,转基因烟草的相对电导率和MDA的含量低于野生型烟草,相对含水量和CAT活性高于野生型烟草。试验表明转sikPIP3烟草的抗旱性高于野生型烟草。(3)经不同温度胁迫处理,转基因烟草的生长表型优于野生型烟草,特别是在-4℃冷处理6h情况下,野生型烟草已经完全萎蔫,转基因烟草只出现少量伤斑;生理指标分析结果表明,转基因烟草的相对电导率和MDA的含量低于野生型烟草,CAT活性高于野生型烟草。试验表明转sikPIP3烟草的抗寒性高于野生型烟草。综合结果表明:sikPIP3基因在抗逆基因工程方面具有较高的应用前景。

利用简并引物克隆天山雪莲sikPIP基因片段及RNAi载体的构建

利用NCBI、Bloekmaker、CODEHOP、Primer Premier5.0等数据库和生物软件设计简并引物并利用简并引物RT-PCR,首次从天山雪莲中克隆到474bp的PIP基因cDNA片段,命名为sikPIP,其与GenBank中非洲杂交菊PIP基因氨基酸序列的同源性高达93.0%。从上述序列中选取200bp的序列,利用2对同尾酶将正义片段和反义片段插入到植物表达载体CAM2300-35S-Ocs中,成功构建天山雪莲RNAi载体CAM2300-35S-Ocs-sikPIP。为接下来的遗传转化,进一步探明sikPIP基因在天山雪莲中的功能奠定了基础。

天山雪莲再生体系的优化及转sikPIP2;7基因的研究

以天山雪莲幼苗叶片为外植体进行再生体系的优化,经农杆菌介导法转化获得转正义sikPIP2;7雪莲植株,对转基因雪莲苗进行低温处理并进行抗逆分析。结果表明,诱导不定芽最佳植物激素组合为MS+0.5mg/L ZT+1.0mg/L NAA;生根阶段活性炭最佳添加量为0.5g/L,蔗糖最佳添加量为20g/L。RTPCR分析表明,在0℃胁迫下转基因植株sikPIP2;7表达量增加;低温胁迫下转基因植株丙二醛(MDA)质量摩尔浓度、相对电导率(REC)、过氧化氢(H2O2)清除速率和超氧化物岐化酶(SOD)活性显著优于对照植株,说明sikPIP2;7过表达提高转基因雪莲抗低温胁迫的能力。

新疆雪莲水孔蛋白sikPIP_1基因的克隆与功能分析

利用PCR技术从已建立的新疆雪莲cDNA文库中克隆雪莲水孔蛋白基因sikPIP1,构建植物表达载体pBI121-sikPIP1,利用农杆菌介导法获得转基因烟草,PCR和RT-PCR检测证明该基因成功导入并得以转录,并对检测结果均为阳性的植株通过水分胁迫和温度胁迫进行抗旱性和抗寒性分析。结果显示:(1)克隆得到长为880 bp,具有水孔蛋白特性的sikPIP1基因,完整ORF为840 bp。(2)水分胁迫中,断水7 d后转基因烟草生长表型明显优于野生型烟草,生理指标测定结果显示,转基因烟草的相对电导率和丙二醛含量均低于野生型烟草,相对含水量高于野生型烟草。(3)不同温度胁迫处理,转基因烟草表型显著优于野生型,特别是0℃以下低温胁迫,野生型烟草出现严重的萎蔫,而转基因烟草受伤害程度较轻;生理指标结果显示转基因烟草相对电导率、丙二醛含量低于野生型烟草。结果表明,转sikPIP1基因提高了烟草抗旱能力和抗寒能力。