两条鲢鱼小清蛋白源抗冻肽的活性及作用机制比较

目的:探讨鲢鱼小清蛋白源抗冻肽的作用机制和构效关系。方法:采用差示扫描量热和分子动力学模拟方法对比分析了两条鲢鱼小清蛋白源抗冻肽的活性、结构及其作用模式。结果:Pv-AFP 1(KAADSFNHKAFFAKVG)呈稳定的α-螺旋结构,而Pv-AFP 2(KAADSFNHKAF)倾向于呈无规卷曲;Pv-AFP 1的热滞值为0.87℃,总平均亲水性为-0.21,热滞活性和两亲性均优于Pv-AFP 2(0.74℃,-0.71);分子动力学模拟显示Pv-AFP 1能结合53个水分子,可形成16个氢键吸附至冰晶表面,结合能为-1514 kJ/mol,均大于Pv-AFP 2(能结合50个水分子,通过形成11个氢键吸附至冰面,结合能为-805 kJ/mol);尽管两条肽序列相似,但其与水分子和冰晶相互作用的主要位点和模式也有一定差异。此外,两条肽均能与冰水界面相互作用,改变了冰面的曲率从而抑制了水的结冰,但Pv-AFP 1抑制冰面生长的效果优于Pv-AFP 2,与热滞活性结果一致。结论:鲢鱼小清蛋白源抗冻肽的活性可能与构象、两亲性及其与水分子和冰晶相互作用的亲和力、位点和模式有关。

糖基化联合磷酸化降低鲢鱼小清蛋白致敏性的机制

以鲢鱼小清蛋白(parvalbumin,PV)为研究对象,采用糖基化联合磷酸化对其进行修饰,运用光谱、质谱和KU812细胞实验等方法研究修饰后鲢鱼PV抗原表位和致敏性的变化。结果表明:糖基化联合磷酸化修饰可增加鲢鱼PV分子质量,降低游离氨基含量,且改变其二级结构和构象结构;糖基化联合磷酸化修饰后的鲢鱼PV含有8个糖基化位点(K33、K46、K55、K65、K84、K88、K97和K108)和1个磷酸化位点(S56)。糖基化联合磷酸化修饰能显著降低鲢鱼PV与IgG/IgE的结合能力,也能降低KU812细胞中组胺和白介素-6的释放能力。因此,糖基化联合磷酸化修饰通过糖基化和磷酸化位点遮掩鲢鱼PV的线性表位和破坏其构象表位,降低其致敏性。研究结果为开发低致敏性鱼类制品提供重要的理论依据。

鲢骨骼肌过敏原小清蛋白的分离纯化及多克隆抗体制备与应用

小清蛋白是鱼类的主要过敏原,对该蛋白的研究不仅有利于过敏原检测方法的建立也可为低致敏性水产品的开发提供理论依据。通过组织捣碎、冷冻离心、热处理、Superdex75凝胶过滤等方法从鲢白色肉中纯化得到过敏原小清蛋白。Tricine-SDS-PAGE显示,在非还原条件下,该蛋白呈分子量分别为12ku、14ku、24ku的3个条带。而在还原条件下,仅有分子量为12ku的条带。Western-blotting分析表明,分子量为12ku、14ku和24ku的这3个条带都与小鼠抗蛙小清蛋白单克隆抗体(PARV-19)发生特异性反应,提示它们均为小清蛋白的不同形态。用纯化的小清蛋白制备多克隆抗体,经Protein A Sepharose亲和层析纯化得到高纯度的免疫球蛋白G(IgG)。Dot-blot检测发现,抗体稀释至1/51200时仍能与纯化的小清蛋白有显色反应。用制备的多克隆抗体进行Western-blotting分析,能特异地检测4种鱼(鲤、鲢、鲫、黄鳍鲷)中的小清蛋白。

鲢鱼小清蛋白的分离纯化及其单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备抗鲢鱼主要过敏原小清蛋白的单克隆抗体,并对其基本特性进行鉴定。方法:采用硫酸铵盐析、离子交换柱层析和凝胶过滤柱层析等方法纯化鲢鱼小清蛋白;以纯化的小清蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体;通过ELISA法确定抗体亚型;通过腹水诱生法大量制备单克隆抗体;以Protein G Sepharose亲和层析柱纯化制备的单克隆抗体;运用Western blot鉴定单克隆抗体的特异性;以ELISA法分析单克隆抗体的结合位点。结果:从100 g鲢鱼肌肉中可获得约30 mg高纯度小清蛋白;SDS-PAGE结果表明,得到的抗小清蛋白单克隆抗体(A4-C1)纯度较高,亚类为IgG1;Western blot结果显示,A4-C1只与鱼肉粗提物中的小清蛋白产生反应,特异性良好;ELISA分析表明,制备的抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体与商品化抗蛙小清蛋白单克隆抗体(PARV-19)的结合位点可能具有很大部分的重叠,或者存在较大的空间位阻效应。结论:研究中制备的杂交瘤细胞株能稳定分泌高特异性的抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体,可用于后续淡水鱼类小清蛋白检测方法的建立。

鲢小清蛋白的cDNA克隆及在大肠杆菌中的原核表达

以鲢(Hypophthalmichthys molitrix)肌肉cDNA为模板,利用小清蛋白特异性引物进行PCR扩增,克隆得到β小清蛋白两种不同亚型,即Ⅰ型、Ⅱ型编码区基因。将目的基因片段连接到pET28a(+)表达载体,并在大肠杆菌[E.coli BL21(DE3)]中诱导表达。结果表明,经诱导的小清蛋白重组质粒菌株有特异的蛋白表达。SDS-PAGE分析显示,目的蛋白的分子量约为13 kD,与预期大小一致。菌体超声破碎后发现2种亚型的小清蛋白均为可溶表达。利用Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,得到高纯度的重组小清蛋白PVⅠ和PVⅡ。经Western Blot鉴定,重组小清蛋白PVⅠ和PVⅡ均能与抗鲢小清蛋白单克隆抗体反应。本研究为进一步分析小清蛋白的结构与致敏性的关系提供了重要的基础。

鲢鱼肌肉中不同亚型小清蛋白的鉴定及序列分析

小清蛋白(parvalbumin,PV)是鱼类的主要过敏原,为了解鱼类中不同亚型PV、氨基酸序列及其蛋白修饰情况,以鲢鱼肌肉为研究对象,经分级盐析、高效液相结合尺寸排阻色谱及高分辨质谱分离纯化鉴定PV亚型,并对其氨基酸序列和蛋白修饰进行研究。结果表明,从鲢鱼肌肉中自制的PV含有3种亚型(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ),其平均分子质量分别为12.0290 kDa、11.5810 kDa和11.6220 kDa;PVI、PVII和PVIII的氨基酸序列分别与蛋白质数据库中鱼类PV亚型Q804W2、Q6IMW7和Q9I8V0的氨基酸序列匹配率为74%、100%和99%,且PVII和PVIII分别与已报道的鲢鱼PV亚型gi 209902357和gi 209902355有着89%和88%的相似性。在蛋白修饰中,除PVI只存在酰基化修饰外,其余2个亚型主要存在磷酸化、酰基化、甲基化和泛素化修饰,且PVII的修饰程度明显高于PVIII和PVI。该研究可为鱼类不同PV亚型的提取、纯化和鉴定提供一种新思路,同时为淡水鱼类及其制品安全性的研究提供科学依据。