反向PCR克隆转基因水稻的外源基因旁侧序列

以反向PCR(IPCR)为基础建立了适合于处理大量材料的克隆转基因水稻中外源基因旁侧序列的技术体系。该方法中用小量法提取转基因水稻总DNA ;总DNA用 10倍过量的限制性内切酶在 50 μL反应体积中进行过夜酶切 ;酶切片段在 2 0 μL体积中进行自连接 ,之后进行套式PCR(nested PCR)扩增旁侧序列。在套式PCR中结合了热启动PCR和降落PCR技术以增强PCR反应的特异性。用这种方法 ,本实验室在一周内克隆了 35个转基因水稻株系中外源基因的旁侧序列 ,长度在 30 0～ 750bp之间 ,PCR产物的特异性用Southern杂交进行了证明。实验结果表明这个方法具有快速、稳定和高效的优点。

不同TAIL-PCR通用引物在转基因大豆、水稻、油菜侧翼序列分离中的应用评价

为研究不同转基因作物T-DNA插入位点侧翼序列分离中所用的通用简并引物对TAIL-PCR的影响,本研究使用5个通用简并引物分别对8个转基因大豆、30个转基因水稻和2个转基因油菜株系进行了TAIL-PCR分析,结果表明,5个简并引物在TAIL-PCR中的扩增效果存在显著差异,同一简并引物在不同转基因物种的扩增效果显著不同。AD1引物在转基因水稻和转基因油菜中扩增效果较好,AD2引物在转基因水稻、油菜和转基因大豆中扩增效果均较好,AD3引物在转基因水稻中扩增出1个株系,在转基因油菜中扩增出1个株系,但AD3引物与pFGC5941 T-DNA RB上游有匹配,不适用于以pFGC5941为载体的转基因材料分析。AD4和AD5 2个引物在3个转基因物种的扩增均较差。对AD1和AD2两个引物的TAIL-PCR扩增产物进行测序,结果表明,扩增产物均对应转基因材料的侧翼序列。研究表明,不同通用引物在不同转基因事件中侧翼序列的分离效果差异较大,通用引物AD1和AD2TAIL-PCR成功率最高。不同通用引物的应用效果不仅与不同物种有关,也与外源基因的插入位点有关,而且还与载体序列匹配程度相关。为提高TAIL-PCR中T-DNA插入位点侧翼序列分离成功率,建议同时采用多个通用引物平行扩增。

应用单引物PCR获得以Bar基因为锚定基因的转基因水稻侧翼序列

确定外源基因在水稻基因组上的插入位置,是转基因水稻研究的重要内容之一。为了建立一种简单、快速、准确的获取外源基因在水稻基因组上插入位置侧翼序列的方法,结合前人TAIL-PCR引物设计的原则和经验,以转入水稻基因组中的Bar基因为锚定基因,设计了既能作为锚定引物又能作为随机引物使用的一系列单引物,应用这些单引物通过单引物PCR成功获得了外源基因在水稻基因组插入位点的侧翼序列。这种方法与目前较为常用的TAIL-PCR相比,简化了70%左右的试验步骤,节省了60%以上的试验时间,是一种简便、快捷的获得未知侧翼序列的方法。

利用Real-time PCR对4个转Bt基因水稻的非预期效应研究

转基因水稻中外源基因的转入可能会形成新的代谢产物,造成农艺性状的改变等,这些均不利于农业生产的非预期效应。为探究转基因水稻是否存在非预期效应,本研究以江西农业大学选育的4个转Bt基因恢复系为试验材料,通过反向PCR扩增侧翼序列并比对,用216对SSR引物对供试材料进行全基因组背景分析,再以Real-time PCR检测外源基因插入位点上下游100 kb内所有基因表达差异,并对光合色素含量及9个主要农艺性状进行显著性分析。结果表明,cry1C侧翼序列片段大小为1 276bp,定位在水稻第11号染色体上,cry2A侧翼序列片段大小为948 bp,定位在水稻第12号染色体上;昌恢121T、昌恢891T、昌恢T025T、R205选T的遗传背景回复率分别为95.60%、88.43%、93.52%、94.44%;基因表达分析显示试验组和对照组在cry1C、cry2A插入位置上下游100 kb内所有侧翼基因的表达水平均无显著性差异;进一步调查发现,试验组和对照组的光合色素含量及9个农艺性状无显著性差异。综上,cry1C和cry2A插入水稻基因组没有改变侧翼100 kb内基因表达水平,且4个转基因水稻并未产生非预期效应。本研究结果为探究转基因水稻的非预期效应评价提供了一定的理论参考。

一种转基因植物高特异定性检测方法

近年来,植物基因工程技术的迅速发展使得转基因植物及其产品与人们生活越来越密切.与此同时,转基因植物检测技术不断丰富和发展,主要是在整合、转录、翻译等不同水平上检测转基因产物的存在.但各种方法都存在不同的缺点,如缺乏特异性、假阳性较高,操作繁琐、成本高等.利用TAIL-PCR(thermal asym-metric interlaced PCR)和融合克隆结合建立一种简单、快速、特异性高的转基因植物检测方法,以两个转基因植株(C3-3株系和TB-5株系)为例,通过TAIL-PCR获得其侧翼序列后设计特异引物,并用于特定转基因植株的筛选.