湘村黑猪sirt2基因多态性及其与肉质性状的关联分析和组织表达研究

本研究旨在探索沉默信号调节子家族(silent information regulator 1-7,SIRT1-7)sirt2基因在湘村黑猪不同组织间的表达及其多态性与肉质性状间的关联性,以期寻找与湘村黑猪肉质性状相关的分子标记。采用PCR-RFLP方法和基因测序技术对湘村黑猪sirt2基因多态位点进行分析,采用实时荧光定量PCR技术对sirt2基因在湘村黑猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰腺、后腿肌和背最长肌8个组织中的相对表达量进行分析,利用SAS 9.4软件对sirt2基因突变位点不同基因型与肌肉色值、pH_(45 min)、pH_(24 h)、滴水损失、失水率、肌内脂肪、嫩度和眼肌面积进行关联分析。结果显示,在湘村黑猪sirt2基因第8外显子扩增片段中的240 bp处发现1处C→T碱基突变,编码氨基酸由精氨酸(Arg)变为半胱氨酸(Cys),为错义突变,并形成CC、CT和TT 3种基因型,CC基因型为优势基因型,C为优势等位基因,经χ~2检验表明该突变位点偏离哈代-温伯格平衡;该位点群体纯合度较高,有效等位基因数为1.301,多态信息含量为0.205,为低度多态(PIC<0.25)。基因多态性与肉质性状关联分析结果表明,TT基因型肉色L~*值和滴水损失显著低于CC和CT基因型(P<0.05),CC基因型失水率显著高于CT和TT基因型(P<0.05)。sirt2基因在湘村黑猪8个组织中均有表达,其中在背最长肌中相对表达量最高,与肺脏中表达量差异不显著(P>0.05),但显著高于心脏、肝脏、脾脏、肾脏、胰腺和后腿肌(P<0.05),且心脏、肝脏、脾脏、肾脏和胰腺中相对表达量差异均不显著(P>0.05)。本试验结果表明,sirt2基因对湘村黑猪肉质性状的发育有一定影响,可作为影响湘村黑猪肉质性状的候选基因进行深入研究。

SIRT2稳定敲除细胞系的建立及对组蛋白修饰的影响

目的利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除SIRT2基因的HEK293细胞系,研究其对组蛋白不同位点的修饰情况。方法构建lentiCRISPR v2-sgRNA SIRT2敲除质粒,通过慢病毒包装,感染HEK293细胞,嘌呤霉素筛选出阳性克隆。对筛选的细胞株进行T7E1验证,来验证所设计的sgRNA的有效性。应用蛋白质免疫印迹检测SIRT2蛋白水平,筛选得到SIRT2稳定敲除细胞系。使用蛋白质免疫印迹的方法在蛋白水平验证SIRT2对组蛋白乙酰化、甲基化的影响。结果通过测序证明lentiCRISPR v2-sgRNA SIRT2敲除质粒正确,T7E1验证了所构建的质粒具有良好的CRISPR/Cas9活性,使基因组碱基发生突变。蛋白质免疫印迹证明SIRT2敲除细胞系中SIRT2表达显著降低。在CRISPR/Cas9系统敲除SIRT2的HEK293细胞中,组蛋白H4乙酰化在赖氨酸第16位(H4K16ac)表达显著升高,组蛋白H4乙酰化在赖氨酸第5位(H4K5ac)表达下降,组蛋白H3二甲基化在赖氨酸第79位(H3K79me2)表达升高。结论获得SIRT2稳定敲除细胞系,便于后续SIRT2对组蛋白修饰功能的研究。

猪Sirt2慢病毒干扰载体的构建

为了研究猪Sirt2基因在脂肪细胞增殖和分化中的作用,试验针对Sirt2基因设计并合成了3对siRNA序列,经退火、酶切后连接于慢病毒表达载体LentiH1上,然后与慢病毒包装质粒混合共转染293T细胞,48 h后收集细胞,浓缩病毒,并检测病毒效价和感染效率。结果表明:3个shRNA慢病毒干扰载体经包装浓缩后获得的病毒效价均为1×107tu/mL;感染猪脂肪细胞后,Western-blot检测表明Sirt2的蛋白表达受到显著抑制,其中1号病毒载体干扰效果最为明显。说明携带靶向Sirt2基因的RNAi慢病毒载体构建成功。

小鼠Sirt2基因的组织表达谱及其成肌细胞分化过程中的时序表达

本实验目的在于检测Sirt2在小鼠各组织器官及成肌分化过程中的表达情况,通过实时定量PCR及Westernblot检测Sirt2在小鼠各组织中的表达,发现Sirt2表达具有广泛性,其中在肌肉与心脏中高表达。进一步检测Sirt2基因在成肌细胞C2C12不同分化时间点的mRNA及蛋白表达情况,结果显示Sirt2在C2C12分化早期高表达,在分化晚期表达降低。Sirt2在成肌细胞分化过程中的差异表达显示,其可能在肌肉发育过程中发挥作用。

SIRT2对脓毒症进展为持续炎症-免疫抑制-分解代谢综合征的预测价值探讨

目的探讨SIRT2对脓毒症进展为持续炎症-免疫抑制-分解代谢综合征(persistent inflammation-immunosuppression and catabolism syndrome,PICS)的预测价值。方法纳入2018年6月到2019年6月收住在天津市第一中心医院重症监护病房的脓毒症患者81例,募集20例健康成年志愿者做为对照。筛选出住院时间超过14 d的患者45例,分为非PICS组和PICS组。采集入院0 h、24 h、4 d、7 d、10 d、14 d、17 d、21 d共8个时间点的血标本(对照组于清晨空腹仅抽取1次),测定不同时间点SIRT2、PD-1、TNF-α、IL-6、IL-10、TGF-β水平。绘制受试者工作特征曲线,计算曲线下面积,评价SIRT2和PD-1对脓毒症进展为PICS的预测价值。结果①非PICS组与PICS组入院时SIRT2和PD-1表达均较对照组低,与非PICS组比较,PICS组SIRT2和PD-1表达先后在10 d及14 d呈升高趋势,两组10 d时SIRT2表达差异有统计学意义(P<0.05),分别为(0.87±0.08)、(1.15±0.09),两组14 d时PD-1表达差异有统计学意义(P<0.05),分别为(0.86±0.04)、(1.01±0.02);②随时间推移,非PICS组与PICS组TNF-α、IL-6呈下降趋势,PICS组IL-10、TGF-β在10 d后先后高于非PICS组(P<0.05)。③PD-1的曲线下面积为0.766(95%CI:0.624~0.908),截断值为1.01时,灵敏度70.8%,特异度81.0%;SIRT2的AUC为0.841(95%CI:0.722~0.960),截断值为1.10时,灵敏度79.2%,特异度81.0%。结论脓毒症患者进入PICS阶段时SIRT2表达水平发生改变;SIRT2对PICS的发生具有一定的预测价值。

沉默SIRT2基因对急性粒细胞白血病细胞增殖的影响

目的 SIRT2是组蛋白去乙酰化酶家族成员之一,其参与多种肿瘤的发生和发展。本研究旨在探讨SIRT2基因在人急性粒细胞白血病细胞NB4和耐药细胞HL60/A增殖中的作用,分析SIRT2对于细胞周期的影响,寻找治疗急性粒细胞白血病的新靶点。方法 蛋白质印迹法检测SIRT2在急性粒细胞白血病细胞HL60/A和NB4中的表达,针对SIRT2mRNA不同的靶序列设计并合成shRNA,构建真核表达干扰载体,制备慢病毒并感染HL60/A和NB4细胞,用嘌呤霉素筛选出稳定表达shRNA的细胞,应用蛋白质印迹法验证干扰效率;采用改良MTT法检测沉默SIRT2基因前后HL60/A和NB4细胞增殖的改变;用流式细胞术检测沉默SIRT2基因前后细胞周期的变化。结果 在HL60/A和NB4细胞中SIRT2蛋白表达水平均增高,F=43.22,P=0.002。用慢病毒感染HL60/A（F=184.9,P〈0.001）和NB4（F=354.7,P〈0.001）后,SIRT2基因的蛋白表达水平显著降低。MTT结果显示,与对照组细胞比较,48h沉默SIRT2基因的HL60/A（F=208.4,P〈0.001）和NB4（F=27.58,P〈0.001）细胞的生长速度变慢;于72h这种抑制作用更加明显,其中HL60/A的增殖速度明显变慢,F=555.9,P〈0.001。流式细胞术检测细胞周期结果显示,G0～G1期百分比,与对照组HL60/A/con（27.62±1.01）%相比,干扰组HL60/A/sh1（37.14±0.03）%（F=7.61,P〈0.001）和HL60/sh2（37.51±3.63）%（F=3.89,P=0.009）比例显著增加;与对照组NB4/con（27.49±0.50）%相比,干扰组NB4/sh1（38.26±1.93）%（F=8.02,P=0.007）和NB4/sh2（35.23±1.11）%（F=3.50,P〈0.001）比例显著增加;S期细胞百分比,与对照组HL60/A/con（51.94±1.15）%相比,干扰组HL60/A/sh1（40.24±0.66）%（F=3.34,P〈0.001）和HL60/sh2（42.73±2.76）%（F=10.33,P=0.004）比例显著降低;与对照组NB4/con（50.65±0.23）%相比,干扰组NB4/sh1（39.58±1.11）%（F=3.02,P〈0.001）和NB4/sh2（43.82±1.33）%（F=10.42,P=0.011）比例显著降低;G2～M期细胞比例无明显变化。结论 干扰SIRT2基因的表达可使细胞周期阻滞在G0～G1期,从而抑制急性粒细胞白血病细胞HL60/A和NB4的增殖。