软土地层三线小角度叠交盾构隧道施工影响规律及位移控制

天津地铁6号线入出段线盾构隧道上穿既有隧道,通过现场实测和数值模拟对既有隧道结构变形规律、变形影响因素、不同变形控制措施的效果进行了研究。结果表明:盾构上穿过程中既有隧道竖向位移整体呈现出隆起-沉降-隆起的变化规律;刀盘距叠交部位断面距离L=2.0D(D为隧道直径)时,叠交部位断面轴力达到最大值,L=0~2.0D时,叠交部位断面弯矩逐渐由L≤0时的横8字形转变为L≥2.0D时的三叶草形;新建隧道与既有隧道的叠交角度在15°~60°、竖向净距小于1.0D时,既有隧道竖向位移受新建隧道影响较大,实际工程中应使叠交角度大于60°,竖向净距大于1.0D;设置支撑台车后,支撑台车影响范围约为2倍台车长度,在影响范围内横断面位移得到控制,但随着支撑台车离开,原来位置处对位移的控制效果逐渐消失;与不注浆相比,深孔注浆加固后既有隧道竖向位移最大值和水平位移最大值分别减小了67.4%、76.0%。

姜家梁遗址叠葬墓相关问题研究

小河沿文化姜家梁遗址中出现了大量的叠葬墓,这些墓均为上下叠葬,人骨多未经扰动,为一次葬,存在至多五人叠葬的现象,且存在部分同性叠葬墓。因这些叠葬墓基本处于墓群边缘且大多无随葬品,故姜家梁遗址中的叠葬墓等级并不高。叠葬墓的出现应与姜家梁先民的联合家庭形式与原始宗教观念相关,先民们希冀使用这种方式令亲人死后的灵魂能够相聚,从而维护自身的氏族观念及内部团结。同为小河沿文化的南宝力皋吐墓地中也出现了一座叠葬墓,但其形制与特征均与姜家梁遗址中的叠葬墓不同,二者之间可能存在一定的交流。

基于遥感和GIS的选址策略研究与实现

以某地新建化工厂选址为例,详细介绍了基于遥感和GIS的工程项目选址建模方法。该方法通过遥感获得地物的空间属性和类别特征,通过GIS的缓冲区分析、再分类、栅格叠加、归组、面积计算等空间分析与统计方法实现满足多个条件的目标区块的提取。作为选址模型的具体实现,以遥感和GIS分析软件为依托,规划出了某地适宜兴建化工厂的区块,实施了化工厂选址的遥感和GIS辅助决策。

一种高效而经济获得长片段基因突变体的方法

重组PCR方法的发展为体外突变技术提供了更快捷、准确的方法.通过改进引物设计和PCR保真性等方法,应用重叠延伸PCR的原理成功地实现了对BA基因的定点突变,并构建了其含有m1,m2,m3和m4的突变体.实验证明通过这种改进方法可以有效地进行长片段基因的突变,并且这种方法与其他方法相比具有简便、快捷、经济、高效的特点.

无乳链球菌GlnR因子DNA结合位点预测及其突变基因的构建

利用生物信息学的方法对无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）GlnR因子与DNA结合的位点进行预测,筛选出GlnR因子中与DNA结合的关键位点的氨基酸残基R47和R48.然后利用重叠PCR的方法将glnR基因上的第139～144位上的碱基CGCCGC突变为GCGGCG,使其编码的2个精氨酸残基突变为丙氨酸残基,将突变基因片段TA克隆至PMD 18-T载体上进行测序验证.测序结果表明,利用重叠PCR成功突变了这6个碱基,为后续研究GlnR因子的突变位点对DNA结合的影响提供了参考.

改进重叠延伸法引入DNA定点突变的新方法

目的:改进重叠延伸PCR法,实现一种引入DNA定点突变的准确简便方法。方法:通过应用不同的扩增酶和反应体系,以重叠延伸PCR的方法产生引入突变位点的DNA片断,然后再亚克隆到载体中。该文以人cyclin D1启动子的NF-κB位点(-39/-30)为例。结果:通过DNA测序证明定点突变成功引入。一次引入4个突变碱基。突变引入率为100%。

利用重叠延伸PCR定点突变衰退病P23基因

分析已知柑桔衰退病强毒系基因组并克隆CTV中一个重要的基因P23.利用重叠延伸PCR法的原理,成功的将P23基因保守序列第206位碱基由C突变成T,由此该位点成为限制性酶(SacI)的识别位点.把改良后的P23基因插入到T载体中,测序发现成功地突变掉目的位点.为进一步利用分子生物学手段研究CTV病毒,克隆突变CTV序列奠定了基础.

基于PCR的质粒快速定点诱变方法建立与评价

基因突变对生命的进化具有重要意义,针对质粒的DNA定点诱变技术也是基因工程、蛋白质工程研究中的重要手段之一。为了提高质粒定点诱变的效率,本研究利用引物部分重叠的设计方案,使用Tm值相对固定的引物设计模式,将同一引物分为重叠区(Tm=50±2℃)和非重叠区(Tm=60±2℃),并在严格控制模板用量(2 pg/kb)的基础上,通过20个PCR循环对目标质粒进行定点诱变扩增,随后取0.5μL产物直接用于转化。在Fast Pfu Fly酶系中,利用此法构建了6个含碱基替换、缺失和插入的质粒,均获得成功,突变效率可达96%以上,阳性克隆获得数达70个以上。此外,利用4种不同PCR酶系对该法的适用性进行了评价,结果表明突变效率均可达93%以上,阳性克隆获得数均在10个以上。通过适当增加PCR模板用量(10 pg/kb)并使用纯化后的PCR产物进行转化,该法可适用于转化效率大于106(cfu/μg)的任意感受态细胞,对应的突变效率可大于91%,阳性克隆获得数大于20。根据本法的作用原理,该方案适合质粒中10~20 bp(因重叠区GC含量及碱基序列的不同而改变)以内的任意碱基替换和插入,以及任意长度的DNA片段缺失。且具有通用性强、耗时少、诱变成功率高、成本低、对感受态及转化效率无特殊要求等优点,适合各实验室的日常研究使用。

牛IL-2cDNA缺失突变的矫正及表达产物生物学活性测定

根据GenBank中的牛IL 2基因序列 ,设计一对引物Pa和Pd ,以牛外周血淋巴细胞为材料 ,用RT PCR方法扩增得到牛IL 2cDNA ,测序发现在扩增产物的第 2 4 0位缺失了一个A碱基。采用重叠延伸剪接术 (SOE法 )向突变体定点插入该碱基 ,然后与表达载体连接 ,获得了正确的表达产物。经RT PCR检测证明 ,重组的牛IL 2蛋白具有较好的生物学活性 ,能诱导肿瘤坏死因子TNF α和干扰素IFN γ的产生。

胡萝卜抗冻蛋白的快速大量突变及原核表达

胡萝卜抗冻(DcAFP)具有典型的LRR特征,由约24个氨基酸残基组成重复单元,其中的保守基序是:P×××××L××L××L×LS×N×L×G×I,其中的保守天冬酰胺在与冰晶表面结合中起着关键的作用．为了探明该关键氨基酸对DcAFP重要性,需要对其进行一系列突变,以检测这些突变体的热滞可能发生的变化,而这需要构建大量的突变体．基于此,采用定点突变技术对该基序中保守的天冬酰胺进行了一系列的疏水性缬氨酸突变和亲水性的谷氨酰胺突变,并将这一系列突变体克隆至原核表达载体pET-11a中,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了高效表达与初步纯化,为后续测定其热滞活性的变化和验证天冬酰胺的重要性打下了基础．

人era的结构特点分析及其定点突变体的构建

目的 构建最近克隆的人era基因的定点突变体。方法 利用数据库对era的结构特点进行分析 ,在此基础上用改良的重叠延伸法分别构建人EraN端和C端的定点突变体。结果 获得了分别针对人EraN端TGP结合结构域 (位于2 9 - 36氨基酸残基 )和C端具有RNA结合活性的KH结构域 (位于 2 97- 340氨基酸残基 )的定点突变体。

CD59分子W40位点基因缺失的构建与活性检测

目的:构建突变型CD59重组质粒,建立高效真核表达系统,探讨W40位点的生物学活性。方法:采用基因点突变技术使CD59W40基因位置缺失,各设计两条互补突变引物和两条常规引物,以已构建的CD59cDNA为模板,三重PCR(Overlap PCR)定点诱变扩增突变基因,重组入克隆载体PMD18-T-Vector,EcoRⅠ单酶切野生型和突变型CD59基因,重组入真核表达质粒pIRES,利用阳离子脂质体(Lipfectamine2000)将重组质粒转染中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary,CHO)进行表达。结果:通过PCR定点诱变成功获得目的CD59突变基因MCD59,酶切鉴定及序列测定证实成功构建了pIRES-MCD59,转染CHO细胞,G418筛选出了稳定细胞克隆,检测筛选MCD59蛋白高表达株。免疫组化、免疫荧光、SDS-PAGE、ELISA验证CD59的表达;荧光染料释放试验研究显示与野生型CD59相比,突变型CD59失去对补体的抑制功能。结论:CD59的W40位点对其功能具有重要作用,封闭此位点可提高补体活性,有望用于肿瘤治疗。

嗜热真菌木聚糖酶1YNA的表达和定点突变

为了进一步提高嗜热真菌(Thermomyces lanuginosus DSM10635)本已较耐热的木聚糖酶1YNA的热稳定性。利用重叠延伸PCR技术从嗜热真菌基因组DNA中扩增获得了木聚糖酶1YNA的基因xyl,将其插入到大肠杆菌表达载体pET-22b(+)中,构建了重组表达质粒pET-22b(+)-xyl。该质粒转化到表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)后获得了能成功表达的工程菌。工程菌表达木聚糖酶1YNA的最适温度为65℃,最适pH值为6.0。其在75℃,pH值为6.5的条件下失活处理30min后还残存有30%的酶活,与嗜热真菌生产的木聚糖酶特性相近。在对该木聚糖酶的N端氨基酸序列进行定点突变后发现,T4A、T4G、T4R均对该木聚糖酶的热稳定性无显著影响,其中T4G突变体的耐热性有变弱的趋势。

重叠延伸PCR对DNA片段进行定点双突变

探讨如何利用重叠延伸PCR对同一靶DNA片段中的两个不同位点实施联合突变。先用野生型DNA作模板,通过一轮重叠延伸PCR,获得突变一个预期位点的DNA片段,再用此突变DNA片段作模板,通过另一轮重叠延伸PCR获得两个预期位点均突变的DNA片段。重叠延伸PCR能对DNA片段进行双突变甚至多点突变,具有简便、快速、经济等特点,在阐明基因的调控机理、改造蛋白质结构等分子生物学领域中具有极大的应用价值。

重叠延伸PCR法构建VPS4B基因定点突变真核表达载体

目的构建含液泡蛋白质分选因子4B(VPS4B)基因定点突变的真核表达载体。方法用RT-PCR法从HuH-7细胞中扩增VPS4B基因,并克隆到真核载体pXF3H上。采用重叠延伸PCR定点突变技术,构建K180Q和E235Q两种突变质粒,经DNA测序确证定点突变的结果,再将VPS4B及两种突变载体转染HepG2细胞,western blot检测融合蛋白表达。结果克隆了VPS4基因,构建了真核载体pXF3H-VPS4B,经重叠延伸PCR得到突变体。DNA测序结果显示,编码180位氨基酸的538～540位碱基由AAG突变为CAG;编码235位氨基酸的703～705位碱基由GAA突变为CAA,其他碱基均无突变。VPS4B及两种突变载体转染HepG2细胞可检出HA-VPS4B融合蛋白表达。结论成功构建了VPS4以及K180Q和E235Q两种突变的真核表达载体。

利用重叠延伸PCR技术进行定点突变研究

[目的]建立一种高效、便捷、经济的DNA定点突变方法。[方法]以重组人组织型纤溶酶原激活剂rPA(Reteplase)基因为模板,采用重叠延伸PCR技术对3个位点进行定点突变,将突变基因片段克隆到克隆载体pEASY-Blunt上,并通过测序验证突变结果。[结果]测序结果表明3个位点的突变结果与预期完全一致,即第10位引入单个碱基A、第137位碱基C突变为G以及第686位碱基G突变为A,通过重叠延伸PCR技术一次引入3个突变碱基,100%的实现目的位点的定点突变。[结论]该研究成功实现目的位点的定点突变,为rPA基因的进一步克隆和功能研究奠定了基础。同时也表明重叠延伸PCR技术是一种高效、便捷、经济的DNA定点突变方法。

EGFR基因G719S和T790M突变载体的构建及临床应用研究

目的构建与宫颈癌组织表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因G719S和T790M位点突变型重组载体,利用其建立分子开关平台检测宫颈癌EGFR基因突变。方法以野生型重组质粒为模板,利用重叠PCR技术,得到突变型融合目的 DNA片段,再将此目的片段连接入p MD19-T质粒中,构建成突变型重组载体,将其转化入大肠埃希菌E.coli DH5α感受态细胞进行表达,用菌液PCR和基因组测序进行鉴定。设计特异性检测引物,建立分子开关检测平台用于临床宫颈癌样本的检测。结果通过基因组测序证实G719S和T790M突变位点成功引入,定点突变载体构建成功。成功建立了分子开关检测平台用于宫颈癌组织DNA的检测。结论利用重叠PCR技术简便、高效地构建了EGFR基因突变重组载体,并建立了分子开关检测平台,为基因定点突变及临床上检测EGFR基因突变提供了新的技术手段。

用改进的重叠PCR引入血管内皮生长因子基因突变

血管内皮生长因子 (vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)的PCR产物克隆于T载体上 ,经转化JM1 0 9感受态菌株后 ,随机挑取 8个白斑菌落 ,混合后制成混合模板 .采用 3条引物 ,做两轮重叠PCR反应 ,获得了VEGF的突变基因 ,经PCR鉴定 ,酶切鉴定和测序分析表明所得基因为目的产物 .实践证明这种突变方法简单快速 。

运用重叠PCR技术构建HCV全长cDNA细胞培养适应性突变体

目的:构建含有不同组合细胞培养适应性突变的丙型肝炎病毒(HCV)全长基因组cDNA。方法:根据HCV全长基因组cDNA序列及突变位点设计引物,运用重叠延伸PCR法对ns3和ns5a基因的E1202G、T1280I和S2197P位点进行细胞培养适应性突变,将突变后的片段分别克隆入pBluescriptIIKS(+)、pRSET-A载体,经测序正确后,分别连入含有HCV全长cDNA的质粒的H/FL相应位置,置换原未突变片段,并进行PCR及酶切鉴定。结果:经PCR、酶切和DNA序列测定证实,预期位点发生突变,而其他序列未发生随机突变。结论:构建了含有不同组合细胞培养适应性突变的HCV全长基因组cDNA突变体,为HCV在细胞内复制机制的研究和可稳定复制、表达的HCV体外培养体系的研究奠定了基础。

重叠延伸PCR技术构建β-环糊精葡糖基转移酶基因的定点突变原核表达载体

采用重叠延伸PCR技术对环糊精葡萄糖基转移酶基因序列中保守区域的二个氨基酸位点Y127,R254进行体外基因定点突变。将突变基因分别亚克隆进pUC-18,经PCR鉴定及序列分析,所转化的Escherichia coli BL21(DE3)中含有插入的突变基因重组质粒,结果表明成功构建了Y127F、R254F二个突变基因的重组表达载体。