siRNA干扰ski基因的表达对人肝癌HepG2细胞生物学功能的影响

目的:设计并化学合成针对原癌基因ski的siRNA分子片段,转染人肝癌HepG2细胞,观察其对HepG2细胞增殖、细胞周期和凋亡等生物学功能方面的影响。方法:设计并化学合成针对原癌基因ski的3个siRNA分子序列,阳离子脂质体法瞬间转染HepG2细胞,运用实时定量PCR法和Western印迹法检测细胞中ski基因在mRNA水平和蛋白水平的变化。然后利用MTT法和流式细胞术检测转染ski-siRNA的HepG2细胞增殖、细胞周期和凋亡等生物学功能方面指标的变化。结果:3对特异性ski-siRNA均有效地抑制了ski基因的表达,以siRNA-B抑制效果最好,可达到70%,而且随着转染时间的延长,ski的表达呈逐步下降趋势。转染ski-siRNA后HepG2细胞的增殖能力明显受到抑制(P<0.05),S期细胞明显减少,是阴性对照组的2倍以上。结论:靶向ski基因的siRNA分子片段可以有效地抑制人肝癌HepG2细胞的生长,使进入S期的细胞明显减少,其作用与下调ski基因的表达有关,ski可能是肝癌治疗的一个潜在靶点。

SKI基因多态性与中国华东地区部分人群非综合征性唇腭裂的相关研究

目的:探讨SKI基因257C>G多态与中国华东地区部分人群非综合征性唇腭裂(NSCL/P)发生的关系。方法:采用病例对照设计,应用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP),进行SKI基因257C>G多态性检测,并进行遗传统计分析。结果:对于SKI基因257C>G,8个杂合子父母及患儿的核心家庭TDT检验(χ2=3.56,P>0.05);50例NSCL/P患儿和50例正常儿童基因型及等位基因频数病例对照研究(χ2=2.08,P>0.05)。结论:SKI基因257C>G位点多态与中国华东地区部分人群NSCL/P的发生无相关性,可能不是NSCL/P的主要易感基因。

复方ANBP启动修复基因Ski双向调节TGF-β/Smad对小鼠创面愈合的影响

目的探讨复方ANBP(由仙鹤草、藕节、乳香、蒲黄组成)促进全层皮肤缺损小鼠愈合的分子机制。方法将C57BL/6小鼠随机分为空白对照组、ANBP组,每组随机分为6 h、3 d、7 d、14 d 4个时间点亚组,制备小鼠背部全层皮肤缺损模型。造模后空白对照组不做任何处理,ANBP组创面覆盖复方ANBP粉末。用免疫组织化学方法检测组织中转化生长因子(TGF)-β1、Sam和Mad同系物(Smad)2/3、Ski基因的蛋白表达量。结果 TGF-β1、Smad2/3的免疫组化结果显示:空白对照组从造模后6 h开始蛋白表达量逐渐升高,造模后7 d达到峰值,造模后14 d降低;ANBP组从造模后6 h开始蛋白表达量逐渐升高,造模后3 d达到峰值,造模后7~14 d蛋白表达量逐渐降低;与空白对照组相比,造模后3 d,ANBP组蛋白表达量显著增高(P<0.05);造模后14 d,ANBP组蛋白表达量显著降低(P<0.05)。TGF-β1蛋白表达量除6 h外,其他各时间点差异均具有统计学意义(P<0.05),Smad2/3蛋白表达量差异均具有统计学意义(P<0.05);Ski的免疫组化结果显示:空白对照组从造模后6 h开始蛋白表达量逐渐升高,造模后3 d达到峰值,造模后7~14 d逐渐降低;ANBP组从造模后6 h开始到14 d蛋白表达量逐渐升高。与空白对照组相比,造模后3 d,ANBP组蛋白表达量显著降低(P<0.05);造模后7~14 d,ANBP组蛋白表达量显著升高(均P<0.05)。结论复方ANBP通过启动关键修复基因Ski双向调节TGF-β/Smad通路,从而促进小鼠背部皮肤创面愈合。

干扰ski基因对视网膜色素上皮细胞增生和周期的影响

目的观察siRNA干扰c—ski对视网膜色素上皮（RPE）细胞增生和周期的影响。方法RPE细胞分为3组：空白对照组（转染时加脂质体）、阴性对照组（无关序列非特异性siRNA转染）和ski—siRNA转染组，另设阳性对照转染组（采用B—actinsiRNA转染）。采用蛋白电泳检测转染24h和48h时的c．ski和CyclinD1蛋白表达变化；比色法检测转染1、2、3、4d时细胞的增生速率；流式细胞术检测转染24h和48h细胞周期的变化。结果与空白对照组和阴性对照组相比，siRNA转染hRPE细胞增生在各个时间点均受到明显抑制（P〈0．05）；3组间RPE细胞c—ski和CyclinD1蛋白表达比较，差异有统计学意义（P〈0．05），与空白对照组和阴性对照组相比，c—skisiRNA转染组c—ski、CyclinD1蛋白表达下降（P〈0．05）。各组GO／G1、S和G2／M期RPE细胞比例比较，差异有统计学意义（P〈0．01），c-skisiRNA组GO／G1期细胞比例高于空白对照组和阴性对照组siRNA组（P〈0．05），S期细胞比例低于空白对照组和阴性对照组siRNA组（P〈0．05）。结论c—ski基因干扰可以有效地抑制RPE细胞增生，该分子机制可能是抑制RPE细胞G1期的调节子cyclinD，造成G0／G1期阻滞，不能进入S期。

清胰化积方下调Ski表达抗胰腺癌生长实验研究

目的探讨清胰化积方(Qingyi Huaji Formula,QYHJ)是否通过下调Ski表达抑制胰腺肿瘤的生长。方法采用Real-time PCR和Western blot对QYHJ治疗后21天人胰腺癌裸小鼠皮下移植瘤Ski mRNA和蛋白表达进行检测;通过慢病毒介导的RNA干扰技术建立Ski低表达人胰腺癌细胞系,并通过建立裸小鼠皮下移植瘤,评价Ski不同表达肿瘤对QYHJ治疗反应性是否存在差异。结果 QYHJ治疗后,人胰腺癌SW1990皮下移植瘤Ski mRNA和蛋白表达与未用QYHJ治疗组比较分别下降了39.6%和41.3%(均P<0.05);建立了Ski低表达SW1990细胞系(SW1990/Ski RNAi)和阴性干扰细胞系(SW1990/con RNAi),其Ski mRNA和蛋白表达量分别是亲代细胞的105%、123%和46%、30%(均P<0.05);SW1990细胞和SW1990/con RNAi细胞皮下移植瘤应用QYHJ治疗后其瘤重抑制率分别为29.6%和32.2%,但SW1990/RNAi细胞组其瘤重抑制率为16.0%～17.8%(均P<0.05)。结论 Ski下调增加了人胰腺癌细胞对QYHJ治疗的敏感性,Ski为QYHJ治疗胰腺癌一个重要作用靶点,其不同表达介导了胰腺癌细胞对QYHJ治疗的反应性差异。

基因治疗用pUC118-ski质粒DNA纯化工艺的建立及其质量控制

目的建立基因治疗用pUC118-ski质粒DNA的纯化工艺,并进行质量鉴定。方法采用碱裂解法粗提质粒,PEG/MgCl2沉淀法初步纯化后,依次通过Sepharose 6 FF分子筛层析、PlasmidSelect Xtra亲和层析和SOURCE30Q离子交换层析纯化质粒DNA。纯化的质粒DNA经琼脂糖凝胶电泳分析超螺旋质粒的比例;紫外分光光度计测定质粒的A260和A280值,以A260/A280比值评价其纯度;CCK-8法检测质粒促原代培养的大鼠皮肤成纤维细胞的增殖活性;BCA法和鲎试剂凝胶法分别检测质粒DNA中残留的蛋白质和内毒素含量;PCR法检测质粒中细菌基因组DNA的含量。结果经Sepharose 6 FF分子筛层析可有效去除质粒DNA中的RNA,经PlasmidSelect Xtra亲和层析能将超螺旋质粒DNA(scDNA)与开环质粒DNA(ocDNA)有效分离,经SOURCE30Q离子交换层析获得的质粒DNA纯度很高,但出现了少量ocDNA。获得的质粒DNA纯品中超螺旋质粒所占比例大于90.5%;纯度(A260/A280)为1.83;促原代培养的大鼠成纤维细胞的增殖活性与空载体组相比提高了22.9%(P<0.05),与纯化前的质粒促细胞增殖活性一致;内毒素含量小于50 Eu/mg;几乎检测不到蛋白质残留;细菌基因组DNA残留量小于1.2μg/mg。结论建立了基因治疗用pUC118-ski质粒DNA的纯化工艺,纯化产品的质量指标均符合国家食品药品监督管理局(SFDA)的标准,为申请该基因药物的临床试验及大规模制备质粒DNA奠定了基础。

持续封闭负压引流材料在会阴部创面治疗中的应用及机制研究

观察和研究持续封闭负压引流材料（VSD）在外科会阴部创面治疗中的应用和机制。采用随机对照研究的方法，我科室2007～2013年间对336例会阴部手术患者（肛周脓肿、骶尾部褥疮等）为研究对象，分别分为干预组168例和对照组168例。干预组采用 VSD 治疗，对照组采用传统换药方法。同时应用免疫组化方法对治疗1周后两组的局部组织 C －ski 表达情况进行比较。应用 VSD 的患者的手术部位或创面取得较理想的治疗效果。创面愈合时间明显缩短，干预组平均为14±1．2 d，而对照组平均为27±1．4 d。而 C －ski 表达在 VSD 组有明显升高，有统计学差异。将 VSD 应用在会阴部创面中，可促进 C －ski 基因表达。该引流材料的应用明显缩短患者住院天数，减少了患者痛苦。

pUC118-ski/DH5α工程菌发酵工艺的优化

目的优化pUC118-ski/DH5α工程菌的发酵工艺。方法筛选高拷贝质粒工程菌,通过优化培养基组分、发酵温度、补料成分和补料方式及培养时间,确定最佳发酵参数;以最佳发酵参数在50 L发酵罐中连续发酵3批,验证优化的发酵工艺的重复性。结果最佳发酵参数为:以甘油为碳源的培养基,发酵温度25℃,以50%Glycerol梯度恒速流加方式补料,培养时间为12 h;以最佳发酵参数在50 L发酵罐中连续发酵3批工程菌,菌体湿重和质粒含量分别达52.7～60.3 g/L和1.79～1.95 mg/g湿菌,质粒拷贝数为1012copies/μl,超螺旋质粒的比例达90%以上。结论优化了pUC118-ski/DH5α工程菌的发酵工艺,为重组质粒的规模化生产及下游纯化奠定了基础。

一个Shprintzen-Goldberg综合征家系的表型与基因变异分析

目的对1例Shprintzen-Goldberg综合征患儿的临床表型和基因变异进行分析,明确其致病原因。方法应用全外显子组测序筛选与表型相关的基因变异,用Sanger测序在其家系成员中进行验证。结果先证者SKI基因(NM_003036)第1外显子存在c.94C>G(p.Leu32Val)杂合变异,其父母未携带相同变异。根据美国医学遗传学与基因组学学会指南,判断该变异为致病性(PS1+PS2+PM1+PM2+PP2+PP3)。结论SKI基因c.94C>G(p.Leu32Val)杂合变异可能是该患者的遗传学病因。