新的高血压相关基因-Slc7a8的实验研究

目的:探讨高血压致病相关基因。方法:提取13周龄SHR和WKY的2、3级肠系膜动脉和肾脏总RNA,利用含10000个基因大鼠表达谱芯片检测2组2、3级肠系膜动脉和肾脏组织基因表达水平不同的基因,并用定量RT-PCR的方法排除假阳性候选基因。结果:芯片发现19个基因在SHR中上调,其中涉及分子伴侣、离子通道和小分子转运、生长因子、细胞信号转导的蛋白和核转录因子、脂蛋白等基因。用定量RT-PCR验证示Slc7a8基因的表达水平在SHR组中比WKY组上调9.3倍。结论:Slc7a8可能与高血压的形成有关,深入研究Slc7a8基因及其功能将为进一步了解高血压病的分子机制提供新的思路和线索。

鲫鱼(Carassius auratus)slc7A8基因分子特征及表达分析

采用RT-PCR和RACE技术克隆鲫鱼slc7A8基因的全长cDNA序列,对基因序列用生物软件对基因进行生物信息分析,用Real-time PCR方法检测基因在组织中的mRNA表达丰度。结果表明,鲫鱼slc7A8cDNA全长为2709bp,包含195bp的5′UCR序列,921bp的3′UCR序列,1593bp开放阅读框,编码530个氨基酸序列;鲫鱼与斑马鱼基因同源性和编码氨基酸同源性分别为88.9%和95.5%,而与其他动物分别在70.1%-74.8%和80.6%-82.1%之间;预测编码蛋白的分子量为57719.84,等电点为4.8,对其结构预测显示该蛋白具有与哺乳动物十分相似的12个螺旋跨膜结构,跨膜区氨基酸高度保守,不同动物间的同源性都在92.2%以上;Real-time PCR检测鲫鱼组织中的mRNA表达丰度高低顺序为前肠、中肠、脑、后肠、肌肉、肾、鳃、心、肝脏。

siRNA干扰SLC7a8对NRK-52E细胞摄取左旋多巴的影响

目的:通过RNA干扰(RNAi)技术选择性下调高血压相关基因SLC7a8的表达,探讨对大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)摄取左旋多巴的影响。方法:设计并合成3个针对大鼠SLC7a8基因的特异性siRNA片段(siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3),以含非特异性编码序列的siRNA-con为对照。将上述3个片段及阴性对照通过阳离子脂质体法转染至NRK-52E内,通过流式细胞仪估算转染效率后经RT-PCR初步筛选高效率干扰片段,用Western blotting检测蛋白水平的干扰效率,采用紫外分光光度法检测空白对照组(blank)、siRNA-con转染组和SLC7a8基因特异性沉默组不同时点(6、12、24、36、48、60、72、120min)NRK-52E内左旋多巴的浓度。结果:流式细胞仪测定siRNA转染NRK-52E效率为94%,RT-PCR初步筛选结果显示siRNA-1、3干扰效率较高,Western blotting检测显示siRNA-3组在蛋白水平的干扰效率较高,而对照组siRNA-con与空白对照组(blank)的SLC7a8表达差异不明显。通过紫外分光光度法检测NRK-52E对左旋多巴的吸收结果显示干扰组不同时点(6、12、24、36、48、60、72、120min)细胞内左旋多巴浓度均低于siRNA-con转染组和空白对照组;对照组siRNA-con与空白对照组相比则无明显差异。结论:RNA干扰技术能选择性下调大鼠肾小管上皮细胞SLC7a8的表达水平;SLC7a8基因特异沉默后NRK-52E对左旋多巴的摄取在各个不同时点(6、12、24、36、48、60、72、120min)均降低。

大鼠SLC7a8基因的克隆及真核表达载体的构建

目的:克隆大鼠左旋氨基酸转运体(SLC7a8)基因cDNA的读码框(CDS),构建携带SLC7a8基因的重组真核表达载体,为进一步研究其在自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)中的功能作准备。方法:从非高血压大鼠(wistar-kyoto,WKY)肾脏组织提取总RNA,通过RT-PCR得到总cDNA,PCR法扩增,产物连接pGEM-T Easy载体测序分析正确后,再以PCR方法扩增,将其连接入真核表达质粒pcDNA3.1(+)。以PCR、双酶切和测序鉴定正确后,将重组载体pcDNA3.1(+)-SLC7a8用脂质体包裹转染大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E),RT-PCR法及Western blotting法分别检测转染后SLC7a8 mRNA及蛋白表达水平。结果:成功克隆了大鼠SLC7a8基因cDNA,重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-SLC7a8构建成功,且证实转染后肾小管上皮细胞的SLC7a8 mRNA及蛋白表达均明显高于空白对照组(P<0.05)及空质粒组(P<0.05)。结论:成功克隆了SLC7a8基因,并构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)-SLC7a8,能够在NRK-52E细胞中获得有效过表达,这为进一步探讨SLC7a8基因的生物学功能奠定了基础。

新的高血压相关基因-SLC7A8的实验研究

目的采用SHR和WKY为动物模型用基因芯片技术对比SHR和WKY的肠系膜二级动脉和肾脏中基因表达谱的改变,并用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和定量RT-PCR证实,筛选出的基因为高血压的发病机制提供新的理论依据。方法提取13周龄SHR和WKY的二级肠系膜动脉和肾脏总RNA,利用含10 000个基因大鼠表达谱芯片检测两组二级肠系膜动脉和肾脏组织基因表达水平不同的基因,并用逆转录-聚合酶链式反应和定量逆转录-聚合酶链式反应方法排除假阳性候选基因。结果芯片发现19个基因在SHR中上调,其中涉及分子伴侣、转运体、生长因子、细胞信号转导的蛋白和核转录因子、脂蛋白等基因。SLC7A8基因的表达水平在SHR组中比WKY组上调9．3倍。SLC7A8(solute carrier family 7,member 8)基因编码的蛋白为2型左旋氨基酸转运体(type 2 L-type amino acid transporter, LAT2),LATl和LAT2均属于SLC7家族。是氨基酸转运体的构成轻链部分。SLC7A8表达在肾、肠、视网膜上皮和牙蕾。近20年来发现多巴胺及其受体和影响其信号传导均和高血压密切相关。肾近端小管缺乏参与多巴胺合成的酪氨酸羟化酶,但能通过重吸收循环滤过的左旋多巴通过芳香族氨基酸脱羧而合成多巴胺。钠离子依赖和PH敏感的LAT2参与左旋多巴的转运。SHR肾小管上皮细胞通过LAT2使左旋多巴重吸收增加,这是肾脏合成多巴胺的关键步骤。在WKY和SHR的肾近球小管上皮中左旋多巴的摄取SHR多于WKY,在WKY几乎全部通过LAT2,而SHR 25％通过LAT2、25％通过钠通道依赖的转运系统B(0)、50％通过LAT1,且LAT1和LAT2蛋白在SHR中明显上调。LAT2在SHR组表达上调,且在4-12周最明显。结论通过基因芯片技术对肠系膜动脉和肾脏组织中基因表达的初步研究,发现部分表达有差异的基因,通过定量逆转录-聚合酶链式反应筛选出SLC7A8基因在SHR组中上调,深入研究SLC7A8基因及其功能,将进一步明确高血压病的分子机制,并可能筛选出特异性的调控基因,发展相应的干预措施,为高血压的临床治疗带来新的突破。