灰飞虱共生菌groEL基因的克隆、生物信息学分析及其植物双元表达载体构建

本研究克隆了江苏南京地区灰飞虱(Laodelphax striatellus Fallén)体内共生菌Wolbachia的groEL基因全长序列。序列分析表明,其开放阅读框为1659bp,编码552个氨基酸残基,分子量为58.884kD,等电点为5.01。序列比对发现克隆的groEL基因与已登录的groEL基因(登录号:EF468716)起始密码子下游424bp处存在一个核苷酸的差异,与另一groEL基因(登录号:DQ356890)完全一致。利用PROTEIN DATA BANK在线软件对灰飞虱的groEL蛋白立体结构进行预测,结果表明灰飞虱的groEL蛋白为同型寡聚复合物,具有分子伴侣功能。本研究进一步构建了含该groEL基因和潮霉素基因的双元表达载体,为下一步转化水稻奠定了基础。

利用MR1523/苏御糯F_(2:3)群体定位水稻抗灰飞虱QTL

灰飞虱是我国水稻生产的主要害虫之一,不仅直接取食危害水稻,还是水稻主要病毒病的传播介体,严重制约水稻生产。籼稻品种MR1523对灰飞虱表现较强的排趋性。为发掘抗灰飞虱新基因,本研究利用MR1523与感虫粳稻品种苏御糯构建了一个包含200个家系的F2:3分离群体,进行灰飞虱抗性鉴定。并利用120对均匀分布在水稻12条染色体的多态性SSR标记,构建了全基因组连锁图谱,进行抗灰飞虱QTL定位。结果分别在水稻第2、第5和第6染色体上检测到Qsbph2、Qsbph5a、Qsbph5b和Qsbph6 4个抗灰飞虱QTLs,分别位于分子标记RM526–RM3763、RM17804–RM13、RM574–RM169和RM190–RM510之间,LOD值分别为2.14、3.13、3.23和2.35,贡献率分别为12.0%、14.7%、17.4%和14.1%,各QTL的抗性等位基因效应均来自抗虫亲本MR1523。该结果为后续抗灰飞虱基因的精细定位及通过分子标记辅助选择培育抗灰飞虱水稻新品种奠定了基础。

Wolbachia在灰飞虱体内的分布

灰飞虱（Ｌａｏｄｅｌｐｈａｘ ｓｔｒｉａｔｅｌｌｕｓ）能传播水稻条纹叶枯病，是我国主要的水稻害虫，有些灰飞虱体内含有细胞内共生茵──Ｗｏｌｂａｃｈｉａ．Ｗｏｌｂａｃｈｉａ是一种细胞质遗传的细胞内共生菌，这类细菌改变了宿主的生殖行为，引起细胞质不相容（ＣＩ），雌性化及孤雌生殖等现象，导致带有Ｗｏｌｂａｃｈｉａ的宿主具有生殖优势．采用ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎ。杂交的方法分析Ｗｏｌｂａｃｈｉａ在灰飞虱体内不同组织的分布状况，发现灰飞虱体内Ｗｏｌｂａｃｈｉａ存在于生殖组织外，还广泛分布在头、胸、腹、唾液腺、消化道等非生殖组织中．这种广泛的分布状态说明Ｗｏｌｂａｃｈｉａ是在昆虫体内引入、表达与传播外源基因的良好媒介．

小麦开花灌浆初期喷施农药对灌浆后期灰飞虱的影响及生化分析

为明确麦田常规使用农药对灌浆后期灰飞虱虫量的影响并揭示原因,为稻麦病虫害的综合治理提供理论依据,通过大田试验,开花初期喷施杀菌剂,花后7d喷施杀虫剂,研究了小麦花后5种农药(杀菌剂:多菌灵、咪鲜胺;杀虫剂:毒死蜱、乐果和吡虫啉)对小麦灌浆后期灰飞虱的影响。结果表明,施用多菌灵、毒死蜱和乐果均能导致小麦灌浆后期灰飞虱虫口密度显著增加,其中毒死蜱和毒死蜱加多菌灵处理分别使虫量增加255.2%和425.6%。花后27d测定小麦叶、穗中的游离氨基酸、还原糖、酚含量和蔗糖转化酶(Invertase,Inv)、多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO)活性,结果显示,与对照相比,除吡虫啉和咪鲜胺外的农药处理均使小麦叶、穗中的游离氨基酸、还原糖含量和Inv活性增加,酚含量和PPO活性降低,以多菌灵加毒死蜱处理的调控效应最大。经相关分析,麦田灰飞虱虫口密度与小麦叶、穗中游离氨基酸含量、还原糖含量和Inv活性呈正相关,与小麦叶中酚含量和PPO活性呈负相关,说明农药对灰飞虱虫量的影响,可能是由于农药使小麦植株生理生化发生变化而引起。把灰飞虱虫量作为重要考虑因素,建议防治小麦赤霉病时宜轮换使用多菌灵与咪鲜胺,防治麦蚜时宜选用吡虫啉。

活跃传毒介体灰飞虱(Laodelphax striatellus)品系的杂交与选育

对水稻条纹叶枯病毒传播介体进行连续4个世代的杂交和严格的人工选育,获得活跃传毒的介体品系,其传毒率从F0群体的5.31%上升到25%,该介体品系经2年时间无人工选择压力的连续饲养,在间断选育的第5代,其传毒率明显下降,仅有14.75%.可见人工选择压对介体传毒力这一性状的稳定起着重要的作用,但对介体获毒没有影响;单头昆虫的DIBA技术使测定标本用量可以少至1/30头灰飞虱,带毒虫率从F0群体的12.09%上升到F4代的32.6%.

灰飞虱高带毒(RSV)群体酵母双杂交cDNA文库的构建

为了研究灰飞虱Laodelphax striatellus Fallén与水稻条纹病毒(rice stripe virus,RSV)互作机制,本研究构建了灰飞虱高带毒群体酵母双杂交cDNA文库。以实验室筛选的灰飞虱高带毒群体为材料,分离纯化mRNA,反转录合成双链cDNA,并连接三框型接头,层析柱分级纯化。采用同源重组反应制备三框型cDNA入门文库,再通过同源重组将入门文库转移到Gateway兼容载体pGADT7-DEST上,构建获得酵母双杂交cDNA文库。检测结果表明:文库库容量为3.68×107cfu,扩增文库滴度为2.62×1010cfu/mL;文库重组率大于95%,cDNA插入片段平均长度>1kb,达到了标准cDNA文库的要求。灰飞虱高带毒群体酵母双杂交cDNA文库的构建为开展昆虫介体与水稻条纹病毒互作机制的研究奠定了基础。

水稻叶色突变对虫害发生影响的研究初报

为明确叶色标记水稻在生产中可能引起的虫害发生变化,本试验在使用和不使用农药防治的情况下,以常规品种嘉禾218为对照,对龙特甫B及其2个叶色突变系黄玉B、翠玉B田间虫害情况进行了调查。龙特甫B为正常绿叶籼稻品种,黄玉B、翠玉B全生育期分别表现黄色和翠绿色,在苗期、分蘖期和抽穗期,黄玉B较龙特甫B的叶绿素含量分别下降58.0%,48.4%和40.8%,翠玉B则分别下降39.5%,36.0%和29.5%。结果表明,秧田期2个叶色突变体上的稻蓟马虫量显著高于其亲本龙特甫B;本田期灰飞虱和褐飞虱的虫口数在不同材料间或差异不显著,或存在显著差异,但没有一定的规律性。但是,2个突变体受稻纵卷叶螟的危害显著轻于龙特甫B,表现为盛发期突变体受稻纵卷叶螟危害产生的虫苞数显著少于龙特甫B,而龙特甫B与嘉禾218之间没有显著差异;相反,2个突变体植株上白背飞虱的虫量显著大于龙特甫B,龙特甫B也显著大于嘉禾218。根据植株的农艺性状和叶绿素含量,以及虫害发生动态变化,笔者推测,造成叶色标记水稻稻纵卷叶螟危害变轻的原因可能与植株叶绿素含量下降,影响幼虫生长发育有关,但引起白背飞虱虫口增加的原因尚需进一步研究。本试验为首次对叶色标记水稻虫害发生情况进行研究,所得结果不但对完善叶色标记水稻生产体系具有指导意义,同时对研究害虫与水稻叶色之间的关系也具有理论价值。

灰飞虱共生菌Wolbachia引起的细胞质不亲和性

对我国6个地区和日本3个地区灰飞虱的Wolbachia感染率，用PCR技术进行了检测，结果表明中国的辽宁、北京、上海和云南的灰飞虱的Wolbachia感染率均接近100％；四川为59．6％；而宁夏为0.各地区灰飞虱间的交配实验证明了Wolbachia引起的细胞质不亲和（CI）现象的存在．Wolbachia16SrDNA的部分测序分析表明，上海、云南和日本出云的灰飞虱感染的同为Wolbachiapipientis。这一结果为掌握灰飞虱-Wolbachia的共生关系，利用灰飞虱体内共生菌防治水稻条叶枯病毒病提供依据．CI现象的研究，可以在多种虫媒传播的动植物疾病防治上应用，开辟出一条基因工程防治的新途径．

利用小RNA深度测序技术检测灰飞虱病毒种类

灰飞虱是一种重要农业害虫,作为病毒介体,可以传播多种植物病毒引起水稻、小麦和玉米等粮食作物病毒病害。目前对于灰飞虱体内昆虫病毒种类尚缺乏系统认识,难以开展利用昆虫病毒防治灰飞虱相关研究工作。为挖掘灰飞虱体内昆虫病毒资源,本文通过小RNA深度测序技术对灰飞虱所携带的病毒种类进行分析鉴定。结果显示,测序数据比对得到13种病毒,涉及8个病毒科和2种未分类病毒。除占据优势的水稻条纹病毒外,其余均为专性寄生的昆虫病毒,包括5种正链RNA病毒、2种单链DNA病毒和5种双链DNA病毒。在这些病毒中,发现了一种与果蝇A病毒较相似的新病毒,克隆出其依赖RNA的RNA聚合酶(RdRP)基因1-1 932位核酸序列,经Blast比对和系统进化分析,在氨基酸序列中发现RdRP掌型亚结构域保守区呈现复制酶置换四体病毒科(Permutotetraviridae)病毒所具有的"C-A-B"排列样式,确定该病毒是一种新的类复制酶置换四体病毒,暂命名为Laodelphax striatellus permutotetra-like virus(LsPLV)。这是首次在半翅目昆虫中发现类复制酶置换四体病毒。本研究表明灰飞虱体内昆虫病毒种类较为丰富,为今后利用昆虫病毒生物防治灰飞虱奠定了基础。

一种室内大量饲养灰飞虱的方法

灰飞虱是重要的农业害虫和病毒传播介体,为给相关研究提供足够的活体材料,建立了一种室内灰飞虱规模化饲养的方法,笔者经一系列生物学试验,对温度、光强、饲养密度等条件进行了优化,并对产卵和换苗时间进行了规定。试验表明饲养温度24-28℃,光照强度5000-7000 lx,不同龄期虫的饲养密度分别为300-400头/杯（若虫）、200-300头/杯（3-4龄虫）、100-200头/杯（成虫）适合各自饲养时水稻苗的生长、灰飞虱的发育繁殖、卵的孵化等。为保证同批次虫龄的一致性,规定产卵时间和换苗时间分别为48 h和8-10天。此方法条件因素明确,可操作性强,不受场地、时间、环境等自然条件限制;可随时提供足量试验用龄次标准试虫。

水稻条纹叶枯病抗性机制研究进展

水稻条纹叶枯病是以灰飞虱为介体传播的病毒病,给中国水稻生产造成了严重损失。利用品种自身的抗病性被认为是防治病害最有力的方法。本文从条纹叶枯病的病害特征、分子生物学研究进展、灰飞虱对条纹叶枯病的传毒特性和鉴定方法及条纹叶枯病抗性遗传的研究进展、抗条纹叶枯病育种研究进展几个方面进行综述,并对水稻抗性研究存在的相关问题和今后研究方向进行了探讨。

水稻黑条矮缩病抗性遗传研究进展

水稻黑条矮缩病(RBSDVD,rice black-streaked dwarf virus disease)是以灰飞虱为主要传毒介体,由水稻黑条矮缩病毒(RBSDV,rice black-streaked dwarf virus)引起的一种水稻病毒性病害。介体灰飞虱一经染毒,终身带毒,但不能通过虫卵传毒。近十几年水稻黑条矮缩病在中国南方稻区广为流行,造成了水稻的严重减产。目前主要通过使用农药来防治其传毒介体灰飞虱,但由于灰飞虱种群数量大,导致其防治效果不佳,而且存在环境污染的忧患,故培育和利用抗水稻黑条矮缩病的水稻品种是综合防治水稻黑条矮缩病的基础。本文对水稻黑条矮缩病的分布及危害、抗病种质资源、抗性鉴定方法、抗病基因/QTL的定位、抗病分子机理及育种进行综述,为开展水稻黑条矮缩病抗性遗传研究和品种选育提供参考。