shRNA抑制人RPE细胞HIF-1α基因表达对VEGF及PEDF表达的影响

目的利用小发卡环RNA(shRNA)使缺氧培养条件下的人视网膜色素上皮(RPE)细胞缺氧诱导因子1α(HIF-1α)基因沉默,观察对血管内皮生长因子(VEGF)及色素上皮衍生因子(PEDF)的影响。方法体外转录法合成对HIF-1αmRNA序列的两个靶点的shRNA,对缺氧(150μmol/L CoCl2模拟)培养条件下人RPE细胞的HIF-1α进行干扰,使用RT-PCR检测HIF-1α、VEGF和PEDF mRNA的表达及Western印迹分析检测HIF-1α、VEGF和PEDF蛋白水平。结果HIF-1αmRNA的两种shRNA均能有效地抑制RPE细胞在缺氧条件下HIF-1α的表达,同时也有效地抑制VEGFmRNA和蛋白表达,并促进PEDF蛋白表达,但对PEDF mRNA的表达无影响。结论HIF-1αmRNA的shRNA能有效地使缺氧条件下RPE细胞HIF-1α基因沉默,进而有效地抑制缺氧对VEGF的上调作用,同时也促进PEDF表达。揭示了HIF-1与缺氧条件下PEDF翻译后的下调机制有关,是促进视网膜新生血管形成最为关键的细胞因子之一。

HIF-1α的RNA干涉可引起缺氧条件下人角膜上皮细胞VEGF表达下调和PEDF表达上调

目的探讨shRNA干扰HIF-1α表达对缺氧条件下人角膜上皮细胞(h CEC)血管内皮生长因子(VEGF)和色素上皮衍生因子(PEDF)表达的影响。方法针对HIF-1αmRNA序列靶点设计及合成3个小发夹RNA(shRNA),分别在体外转染自发永生化人角膜上皮细胞(S-ihCEC),转染后的S-ihCEC在1 mmol/L Co Cl2中缺氧诱导培养6 h,实时定量PCR检测HIF-1α、VEGF、PEDF的mRNA表达,Western blot法检测HIF-1α、VEGF的蛋白表达,ELISA检测PEDF的水平。结果与缺氧组比较,转染HIF-1αshRNA的S-ihCEC中HIF-1αmRNA表达下调、HIF-1α蛋白表达下调,VEGF mRNA表达下调、VEGF蛋白表达下调,PEDF mRNA表达上调(1. 22±0. 18)倍,PEDF水平升高。结论针对HIF-1α的shRNA能有效干扰S-ihCEC中HIF-1α的表达,并下调VEGF表达、上调PEDF的表达。

小发夹RNA在稀有鮈鲫胚胎中的表达

由小的干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)是近年来快速发展的一种转录后基因沉默方法,已被广泛的应用于基因功能的研究,基因网络调控的探讨以及疾病的治疗等方面。多数的siRNA表达载体依赖RNA聚合酶Ⅲ启动子中的一种,操纵一段短发夹结构RNA(Small hairpin RNA,shRNA)在细胞或体内表达。这一类启动子主要包括人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子等。为了探明鱼类自身的RNA聚合酶Ⅲ启动子是否能有效驱动shRNA在鱼体内表达,从而更好地利用RNAi进行鱼类基因功能和抗病毒研究,研究利用斑马鱼的H1和U6启动子以及草鱼的H1启动子,以草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)外衣壳蛋白VP7基因为靶基因,以增强型绿色荧光蛋白(eGFP)为报告基因,分别构建了三个shRNA表达载体:pZH1siGCRV-CMVeGFP、pZU6siGCRV-CMVeGFP和pCH1siGCRV-CMVeGFP。通过显微注射将三种表达载体分别导入稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)受精卵中。由于siRNA片段很短,其表达检测非常困难,研究采用stem-loop RT-PCR方法,对稀有鮈鲫胚胎发育不同时期的shRNA表达进行了检测。研究结果表明,采用的三种鱼类自身的RNA聚合酶Ⅲ启动子均能有效驱动GCRVsiRNA的表达;在取样的各个胚胎发育时期均能检测到GCRV siRNA的表达;stem-loop RT-PCR方法可以便捷检测siRNA的表达。研究构建的鱼类胚胎siRNA有效持续表达载体,建立的简易快捷siRNA检测方法,为进一步的抗GCRV转基因鱼研制以及siRNA的病毒复制干扰机制研究奠定了重要基础并提供有力的技术支撑。