四环素诱导的YAP1敲减系统的建立及其对胃癌细胞功能的影响

目的建立一种四环素(tetracycline,DOX)诱导的基因敲减系统,并利用此系统研究YAP1对胃癌细胞功能的影响。方法构建pLKO.1-tetON-YAP1敲减的慢病毒载体,酶切和测序方法检测载体构建成功与否;慢病毒感染胃癌细胞系SGC-7901和MKN-28,建立DOX诱导的YAP1敲减的胃癌细胞系;RT-PCR检测YAP1 mRNA相对表达量,Western blotting检测YAP1蛋白水平变化;平板克隆实验检测细胞增殖情况;划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移的情况。结果构建四环素诱导的YAP1敲减的病毒质粒,酶切鉴定结果显示,在6000 bp和3000 bp处各有一条带,测序结果与设计的shRNA序列一致。包装慢病毒并感染胃癌细胞系SGC-7901和MKN-28,DOX诱导组中,感染pLKO.1-tetON-YAP1的病毒的细胞中YAP1 mRNA的相对表达量和蛋白水平明显下调;而未诱导组则无明显变化。平板克隆形成实验结果显示,DOX诱导后shYAP1组克隆形成数明显降低;未诱导组无明显变化。划痕实验和Transwell迁移实验结果显示,DOX诱导后shYAP1组表达后细胞迁移能力受到抑制,未诱导组无明显变化。结论成功建立了四环素诱导的慢病毒系统,利用此系统敲减胃癌细胞YAP1基因,胃癌细胞增殖和迁移能力受到抑制。