Expression analysis of two reverse duplicated small heat shock protein genes in rice(Oryza sativa L.)

supported by grants from the National Natural Science Foundation of China （30671178）;the Shanxi Province Science Foundation for Youths, China （2014021029-2）

莲草直胸跳甲热激基因sHsp21在湖南和海南两个地理种群中的差异表达分析

sHsp21(小热激蛋白)是小热激蛋白家族的成员,在外界环境压力下能够被诱导,热激后能够调节蛋白质的折叠和保护细胞免受外界胁迫。本文研究了入侵杂草空心莲子草Alternanthera philoxeroides生防天敌莲草直胸跳甲的一个关键基因sHsp21,并对其进行热激诱导表达以及RACE全长扩增。获得全长cDNA 693 bp并完整的开放阅读框567 bp,共编码188个氨基酸。以30℃为对照,分别测定莲草直胸跳甲Agasicles hygrophila Selman&Vogt长沙种群和海南种群在模拟夏季特定10∶00-14∶00时段36℃、39℃高温条件下sHsp21的表达量。连续热激6 d,每天4 h热激后取样,实时荧光定量PCR分析显示:湖南种群高温39℃和36℃诱导下sHsp21表达量都显著高于对照组30℃;海南种群36℃诱导下的表达量与对照组30℃差异不显著,39℃诱导下的表达量显著高于对照组30℃和36℃。结果表明,sHsp21在湖南和海南两地理种群不同耐热能力上起到重要作用,并且sHsp21的高表达可能对其虫体产生副作用,为下一步深入探究其生物学功能奠定了一定的基础。

不结球白菜热激蛋白基因克隆及表达

从不结球白菜‘暑绿’中克隆到一个受热激诱导的小分子量热激蛋白(sHSP)基因,命名为BcHSP(DDBJ登录号为AB367955),该基因核苷酸序列全长722bp,编码157个氨基酸,与芜菁、芥蓝、拟南芥等有90%以上的相似性。实时定量检测表明,不结球白菜BcHSP转录表达受热激诱导,以叶片中表达量最高,BcHSP在不结球白菜叶片中表达特征说明它可能与植物叶片的耐热性关系更为密切。

甜椒细胞质小分子量热激蛋白基因(CaHSP18)的cDNA克隆与表达

用RT-PCR和RACE-PCR技术,从热激处理的甜椒叶片总RNA中扩增出了细胞质小分子量热激蛋白(sHSP)全长779bp的cDNA基因序列,包含一个480bp开放阅读框,编码159个氨基酸。Southern杂交结果表明在甜椒基因组中有该基因的小的多基因家族。Northern结果显示该基因在甜椒根、茎、叶中的表达受热激和低温的诱导。原核表达分析表明该基因在高温以及低温条件下可以提高大肠杆菌的生存能力。

甜椒CaHSP26的cDNA克隆与表达

用RT-PCR技术从热激处理的甜椒(Capsicum annuumL.)叶片中克隆了叶绿体小分子量热激蛋白(sHSP)基因的cDNA序列,其全长为917bp,命名为CaHSP26。Southern杂交分析表明该基因在甜椒基因组中为单基因。Northern杂交结果显示该基因在甜椒根、茎、叶中受高温诱导表达。高温(50℃)胁迫下,在大肠杆菌中异源表达CaHSP26可以维持大肠杆菌较高的细胞活力。这些结果表明在高温胁迫下植物叶绿体sHSP对细胞具有保护作用。

紫茎泽兰细胞质小热激蛋白HSP17.7基因的cDNA克隆与表达

利用RT-PCR和RACE-PCR技术,从热激处理的紫茎泽兰叶片总RNA中扩增出了细胞质小分子量热激蛋白(sHSP)全长683 bp的cDNA基因序列。在GeneBank上的登录号是EF105483。通过半定量分析,HSP17.7基因编码的热激蛋白在常温下有表达,且叶、茎中的表达量比根中的高;在热激(40℃)和冷处理(4℃)的情况下,根、茎、叶中的表达量均有增加。为研究基因在温度胁迫下的功能,将HSP17.7基因在大肠杆菌中表达。在细胞致死温度(50℃)下,HSP17.7能够改善细胞死亡的现象;4℃条件下,也得到相同结果。这些结果表明,HSP17.7可能在紫茎泽兰耐温度胁迫中发挥作用。

线虫中的小分子热休克蛋白HSP12.1具有类分子伴侣活性

很多种类的小分子热休克蛋白(small heat shock protein,sHSP)都能在胁迫条件下抑制蛋白质的聚集,显示出了类分子伴侣活性,这种活性是ATP非依赖型的.从已经进行的实验发现,线虫C.elegans中最小的小分子热休克蛋白家族成员HSP12.1具有类分子伴侣活性,以胰岛素、乙醇脱氢酶和溶菌酶做底物发现HSP12.1能够一定程度地抑制底物的热聚集,虽然这种活性较一些经典的分子伴侣蛋白(线虫中的HSP16.1)要低.与此不同,另外3种和其分子质量相近的sHSP12s(HSP12.2、HSP12.3和HSP12.6)却没有检测出这样的类分子伴侣活性,虽然它们在一级结构上有很高的相似性.另外,在大肠杆菌中表达HSP12.1蛋白能够提高细菌在高温环境下的生存率,45℃处理后的生存率比未表达HSP12.1的菌高4倍左右,不过在线虫中是否发挥同样的功能还不是很清楚.从研究结果来看,C端“尾巴”结构域对sHSP发挥类分子伴侣活性不是必要的,在HSP12.1中没有C端“尾巴”结构域也有类分子伴侣活性就证明了这一点.N端结构域可能在发挥类分子伴侣活性中发挥比较重要的作用,当然α-crystallin结构域也可能参与到发挥这样的功能当中.

花楸树小热激蛋白23.8基因(SpHSP23.8)克隆与表达分析

以花楸树〔Sorbus pohuashanensis(Hance)Hedl.〕为研究对象,对其小热激蛋白23.8基因(SpHSP23.8)的克隆、组织特异性表达以及响应非生物胁迫的表达进行研究。结果表明:SpHSP23.8基因开放阅读框(ORF)包含648个碱基,编码215个氨基酸,其编码氨基酸序列的理论相对分子质量约23800,该基因包含1个内含子。氨基酸序列比对结果显示:SpHSP23.8蛋白与枇杷〔Eriobotrya japonica(Thunb.)Lindl.〕EjsHSP6蛋白(登录号AKP06201.1)的同源性最高。根据SpHSP23.8蛋白与模式植物小热激蛋白氨基酸序列的聚类分析结果,推测SpHSP23.8蛋白定位于线粒体中。组织特异性表达结果显示:SpHSP23.8基因在茎中的相对表达量最高,其次为果实和根,而花中的相对表达量最低。高温、NaCl及干旱胁迫下,花楸树叶片中SpHSP23.8基因的相对表达量显著升高。随着高温胁迫时间的延长,SpHSP23.8基因的相对表达量呈先升高后降低的变化趋势,且在胁迫2.00 h达到峰值;在NaCl和干旱胁迫下,SpHSP23.8基因的相对表达量均呈升高的变化趋势。高温、NaCl和干旱胁迫下,SpHSP23.8基因在转SpHSP23.8基因拟南芥〔Arabidopsis thaliana(Linn.)Heynh.〕中的表达趋势与其在相应胁迫条件下花楸树中的表达趋势一致。上述研究结果表明:SpHSP23.8基因参与了花楸树对高温、NaCl和干旱胁迫的响应,在花楸树引种驯化的适应性方面起着一定的作用。

四纹豆象小分子量热激蛋白基因的鉴定与表达分析

本研究利用生物信息学方法对NCBI数据库中四纹豆象(Callosobruchus maculatus)全部热激蛋白进行分析,从中鉴定出一种中央区具有典型α-晶体蛋白质结构域的小分子量热激蛋白基因,shsp27(Gen Bank编号FK669241.1)。采用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测了四纹豆象4龄幼虫经不同温度(4、15、30、37℃以及4℃低温处理24 h后回复30℃)胁迫处理24 h后,shsp27 m RNA的相对表达量。分析结果表明,在4龄四纹豆象幼虫中,低温(4、15℃)与高温(37℃)胁迫处理后shsp27的相对表达量相对于对照组(30℃恒温培养组)均有上调响应,但对高温胁迫的响应程度略强,低温回复处理组的相对表达量也略高于对照组,但上升不显著,初步认为shsp27基因表达与四纹豆象耐寒热的适应性无直接相关性。

一个水稻小热休克蛋白基因的克隆和鉴定

小分子热休克蛋白(SHSP)广泛存在于各类生物体中且在生物发育和逆境响应过程中发挥重要作用。我们克隆了一个水稻小热休克蛋白基因(OsSHSP17.6),序列分析表明该基因编码区为477bp,可编码一个含158个氨基酸的多肽,分子量约17.6kD。序列分析显示该类SHSP在不同的植物中是保守的,在分类上隶属于CI类。实时定量RT-PCR分析显示热激处理可显著增强该基因的转录;Western blotting分析显示该蛋白大小与预期一致,且其含量在热激处理时大幅度增加。这些结果一致表明OsSHSP17.6可能参与了水稻热应激反应,这为进一步鉴定OsSHSP17.6的功能提供了基础。

一个水稻小热休克蛋白的异源表达及寡聚特性分析

【目的】在前期研究中,本实验室已克隆了一个水稻小热休克蛋白基因(OsSHSP17.6),并发现该基因的表达明显受到热激和病毒侵染调控,表明该蛋白可能在逆境胁迫过程中起重要作用。本研究的目的在于进一步明确OsSHSP17.6的特性。【方法】在本研究中,进一步将该基因亚克隆至原核表达载体p ET-32a并导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)pLysS诱导表达,通过亲和层析的方法纯化了该重组蛋白,进一步用于非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blotting分析。【结果】异源表达的重组OsSHSP17.6能减轻IPTG对宿主菌的毒害。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blotting分析显示纯化的重组OsSHSP17.6蛋白在体外能形成同源二聚体和寡聚体。【结论】这些结果支持OsSHSP17.6是一个有功能的分子伴侣蛋白并表明该蛋白可能通过形成同源寡聚体的方式参与逆境胁迫反应,这为进一步明确OsSHSP17.6的功能机制奠定基础。

热休克蛋白对枯草芽孢杆菌抗逆性和乙醇产量的影响

[目的]研究热休克蛋白对增强枯草芽孢杆菌的抗逆性和增加乙醇产量的影响。[方法]运用基因工程技术,用大肠杆菌的Lac启动子、运动发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶基因(pdc)和乙醇脱氢酶基因(adhB),构建在枯草芽孢杆菌中表达的BLAP操纵子,BLAP操纵子导入枯草芽孢杆菌可使其发酵糖生产乙醇。然后用超嗜热菌强烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)的小分子热休克蛋白基因(sHsp)构建在枯草芽孢杆菌中表达的BLAPH操纵子。[结果]成功地构建了能表达小分子热休克蛋白,产生乙醇的枯草芽孢杆菌。[结论]小分子热休克蛋白的表达,使枯草芽孢杆菌在致死温度下的存活率显著提高,对温度及乙醇的耐受性显著增强。同时枯草芽孢杆菌的乙醇产量显著提高。

甜菜热激蛋白基因BvHSP18.2的克隆和生物信息学分析

旨在通过基因克隆及生物信息学分析,预测甜菜小分子热激蛋白BvHSP18.2(LOC104903994)的功能。以甜菜‘780016B/12优’为试验材料克隆BvHSP18.2,获得BvHSP18.2基因全长;通过ProtParam tool、SWISS-MODEL、MEGA11等对BvHSP18.2的理化性质、蛋白结构、多序列比对等信息进行分析。RT-PCR扩增得到的BvHSP18.2基因全长为962 bp,编码158个氨基酸,分子式为C_(928)H_(1466)N_(266)O_(284)S_(6),属亲水性不稳定的小分子热激蛋白家族;该基因编码蛋白含13个磷酸化位点,α螺旋和无规则卷曲等主要构件。进化关系发现BvHSP18.2与藜麦、菠菜的sHSP同源性相似。同时,BvHSP18.2基因启动子区域具有参与防御和应激反应等顺式作用元件,推测其在甜菜生长发育和胁迫应答中发挥重要作用。本结果为进一步开展该基因的功能和遗传调控机制研究奠定了基础。

结核分枝杆菌分子伴侣Acr2蛋白的原核表达及其功能分析

目的 在E.coli中表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)分子伴侣Acr2蛋白,并分析其功能。方法 将重组质粒pET-28a-Acr2转化感受态E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达His-Acr2蛋白,经Ni-NTA层析及SuperdexTM200 10/300 GL凝胶过滤层析纯化获得Acr2蛋白。将Acr2蛋白经热变性(100℃温浴15 min)及化学变性(8 mol/L尿素,37℃温浴4 h)后进行自发再折叠和再组装的复性处理,采用圆二色性光谱法和非变性SDS-PAGE检测变性及复性后Acr2蛋白的二级结构。通过底物结合试验检测Acr2蛋白在体外的分子伴侣功能。结果 纯化Acr2蛋白的相对分子质量约为232 000,纯度达90%以上,浓度约为2 mg/mL。Acr2蛋白经变性-复性处理后可恢复其天然二级结构,且在48℃条件下可与变性的苹果酸激酶(malate dehydrogenase,MDH)形成稳定复合物。结论 Acr2蛋白经变性-复性处理后可恢复其天然分子构象,且具有体外分子伴侣活性。本研究为制备具有天然活性的结核杆菌蛋白抗原提供了新策略。

氟他胺致小鼠阴茎组织中sHsps表达改变的研究

目的:研究氟他胺致小分子热休克蛋白基因(s Hsps)在小鼠阴茎组织中的表达改变。方法:ICR小鼠受孕后,将其随机分为实验、对照两组,实验组和对照组各16只,于孕12d(GD12)-GD19,每天经口给予实验组孕鼠混悬于玉米油中的氟他胺80 mg/kg/day,对照组孕鼠给予等体积的玉米油。分别于出生后第7、21天(PND7、PND21)在对照组、实验组随机取8窝子鼠,并在对照组随机选取雄性小鼠1只,实验组选取肛门与生殖器之间的距离(AGD)正常和异常雄性小鼠各1只。取上述雄性子鼠的阴茎,利用实时荧光定量PCR相对定量检测阴茎组织中s Hsps的表达丰度。结果:无论是实验组还是对照组,sHsps在PND7、PND21的小鼠阴茎组织中都有表达。除Hspb9在PND7实验组AGD"正常"雄性子鼠阴茎中的表达和对照组无差异外,Hsp27、Hspb3、Hspb5、Hsp20、Hspb9在实验组PND7、PND21中的表达均高于对照组。实验组Hsp25、Hspb2、Hspb4、Hspb10、HO-1在PND7、PND21的表达均低于对照组。实验组Hsp22在PND7的表达和对照组无差异,但在PND21的表达则高于对照组。Hspb7在PND7实验组中的表达高于对照组,而在PND21实验组中的表达则低于对照组。结论:Hsp25、Hspb2、Hspb4、Hspb10、HO-1可能和小鼠阴茎异常发生有关,Hspb7可能是小鼠阴茎发育中起重要作用的基因,而Hsp27、Hspb3、Hspb5、Hsp20、Hspb9和Hsp22在小鼠阴茎发育时可能起应激保护作用。

小热应激蛋白与动物繁殖机能的关系研究进展

热应激是指机体受到超过本身体温调节能力的高温刺激而产生的非特异性防御反应,热应激蛋白是机体热应激反应发生后细胞新合成或合成数量增加的一类蛋白质,小分子热应激蛋白是热应激蛋白家族中重要的一类成员,作为分子伴侣在细胞的正常代谢和生理条件下表达和发挥作用。目前已证实小热应激蛋白还参与调控细胞增殖和凋亡、生物膜膜脂的流动性、核质穿梭作用、免疫应答和疾病治疗等。本综述分别就小热应激蛋白在雄性动物生精细胞发育过程中参与的增殖、分化及凋亡调控作用以及在雌性动物卵母细胞发育、成熟、妊娠维持和生育调节功能的研究进展做一概述,旨在为小热应激蛋白生物学功能深入研究提供参考。

白木香2个小分子热激蛋白基因的克隆及表达分析

目的从白木香Aquilaria sinensis中克隆sHSP1和sHSP2基因,并对它们的生物信息学及表达模式进行分析。方法根据本课题组白木香转录组数据库进行分析获得2条具有小分子热激蛋白(sHSPs)保守结构域的sHSPs基因序列,利用RT-PCR技术克隆sHSP1和sHSP2基因的全长c DNA序列,并对其进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR检测sHSP1和sHSP2基因在不同组织和高盐及外源ABA、SA、MJ处理下不同时间的表达差异。结果克隆得到的白木香sHSP1和sHSP2基因开放阅读框都为474 bp,编码157个氨基酸。组织表达分析的结果显示,sHSP1和sHSP2基因主要在根中表达,在茎和叶中的表达量较少;白木香愈伤组织在高盐处理下,sHSP1和sHSP2基因分别在36 h和24 h达到最高表达水平,而愈伤组织在外源ABA、MJ处理下,sHSP1和sHSP2基因都在12 h达到最高表达水平,在SA处理下,sHSP1和sHSP2基因分别在12、24 h达到最高表达水平。结论获得了sHSP1和sHSP2 2基因全长c DNA序列,且2个基因在不同组织根、茎、叶中的表达存在差异性,在受到高盐和外源ABA、SA、MJ处理时,在不同时间的愈伤组织中的表达及积累情况也不同,该研究为后续深入研究白木香防御反应奠定了基础。

肌肉中的小热休克蛋白及其对肌肉品质的影响

肌肉品质是肉类生产者和消费者关注的重点,肌肉蛋白质的状态是影响肌肉品质形成的主要因素。小热休克蛋白(small heat shock proteins,s HSPs)作为一种热应激蛋白广泛分布于生物体中。该蛋白具有抗细胞凋亡和分子伴侣功能,可促进蛋白质在合成过程中的正确装配和折叠,影响肌肉品质的形成。简述了s HSPs的结构和功能,并综述了其对肉品品质形成的影响,特别是对肌肉类嫩度、色泽和保水性的作用,以期为提高肉品品质提供理论基础。