DNA载体介导的小干扰RNA Tet-on基因表达系统的调控效应检测

目的观察构建的DNA载体介导的小干扰RNA Tet-on基因表达系统的调控效应。方法构建DNA载体介导的小干扰RNA(siRNA)Tet-on表达载体,pDIRS4.1 siRNA。以增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因和白细胞介素6(IL-6)基因为目的基因,应用脂质体介导的瞬时转染方法,分别将pDIRS4.1/EGFP siRNA载体和p EGFP-N3质粒、pDIRS4.1IL-6siRNA载体和p IRESIL-6质粒共转染人成骨肉瘤细胞,加入系列浓度的四环素(Dox)后,观察其诱导效应。结果 pDIRS4.1 siRNA在人成骨肉瘤细胞中能够高效转染;随着Dox浓度升高,pDIRS4.1 siRNA载体在人成骨肉瘤细胞中对目的基因的沉默作用有较好的调控性,且目的基因的表达与Dox具有严格的剂量依赖关系,高浓度Dox时,IL-6表达水平降低约12倍。结论该研究构建的以DNA载体介导的能够高效调控siRNA沉默基因效应的Tet-On基因表达系统,能够促进其在更多模型系统中进行基因功能研究的应用。

LV-ERK1-RNAi转染人非小细胞肺癌细胞的ERK1/2、DNA甲基转移酶1表达观察

目的观察细胞外信号调节激酶1基因RNA干扰慢病毒载体(LV-ERK1-RNAi)转染后人非小细胞肺癌(NSCLC)细胞NCI-H1299中细胞外信号调节激酶1(ERK1)、ERK2、DNA甲基转移酶1(DNMT1) mRNA及ERK1、磷酸化ERK1(p-ERK1)、DNMT1蛋白表达情况。方法体外培养NCI-H1299细胞,将细胞随机分为3组,KD组和NC组细胞分别转染LV-ERK1-RNAi、阴性对照病毒,CON组不作处理。转染72 h后,采用荧光显微镜观察细胞荧光率,实时荧光定量基因扩增法检测细胞中ERK1/2、DNMT1 mRNA,蛋白免疫印迹法检测细胞中ERK1、p-ERK1、DNMT1蛋白。结果空白对照组细胞无绿色荧光蛋白表达,阴性对照病毒组、LV-ERK1-RNAi组转染效率达80%以上。与NC组、CON组比较,KD组ERK1、DNMT1 mRNA及ERK1、p-ERK1、DNMT1蛋白表达下降(P均<0. 05)。结论 LV-ERK1-RNAi转染后NCI-H1299细胞ERK1、DNMT1 mRNA及ERK1、p-ERK1、DNMT1蛋白表达降低,ERK2表达正常,表明LV-ERK1-RNAi特异敲低ERK1而调控DNMT1的表达。