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采用GFP标记筛选抑制多血清型口蹄疫病毒3C基因表达的siRNA
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作者 张志彬 张健 +3 位作者 贺明 高倍瑶 贾琪 张立春 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2023年第8期1-5,共5页
为筛选出可抑制多种血清型口蹄疫病毒(FMDV)的小干扰RNA(siRNA),本试验通过多血清型口蹄疫病毒序列比对与siRNA设计分析,筛选出潜在抗多血清型siRNA位点;通过体外合成A型、O型和Asia I型病毒部分基因序列,制备绿色荧光蛋白(GPF)基因融... 为筛选出可抑制多种血清型口蹄疫病毒(FMDV)的小干扰RNA(siRNA),本试验通过多血清型口蹄疫病毒序列比对与siRNA设计分析,筛选出潜在抗多血清型siRNA位点;通过体外合成A型、O型和Asia I型病毒部分基因序列,制备绿色荧光蛋白(GPF)基因融合表达载体;将化学合成的siRNA与融合表达载体共转染,通过GFP观察、Western blot和实时荧光定量反转录PCR(qRT-PCR)方法检验目标siRNA对融合基因的抑制效率。生物信息分析发现,多血清型口蹄疫病毒3C基因高度保守并存在潜在siRNA作用靶位,GFP-3C融合表达载体成功构建,与化学合成的siRNA1-3C共转染293T细胞,GFP观察发现,siRNA1-3C可有效抑制来源于A型、O型和Asia I型3C基因的GFP-3C荧光信号且持续时间达72 h,Western blot检测证实此结果。qRT-PCR检测发现,siRNA1-3C对3个GFP-3C融合基因转录水平抑制效率超85%,且作用可维持72 h。本试验利用GFP作为筛选标记成功筛选出1个作用于FMDV 3C基因的siRNA,为开发多血清型口蹄疫抑制剂提供参考依据。 展开更多
关键词 小干扰rna(sirna) 口蹄疫(FMD) 绿色荧光蛋白(GFP) 多血清型 3C基因
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一链双靶siRNA对皮肤鳞状细胞癌NET-1和Survivin基因表达及增殖和凋亡的影响研究
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作者 季周婧 张丽丽 张捷 《交通医学》 2023年第1期14-19,23,共7页
目的:探讨一链双靶siRNA对人皮肤鳞癌细胞株(A431)NET-1和Survivin基因的抑制作用以及对细胞增殖、凋亡的影响。方法:构建siRNA NET-1、siRNA Survivin以及同时靶向NET-1和Survivin基因的一链双靶siRNA。采用免疫共沉淀法检测NET-1和Sur... 目的:探讨一链双靶siRNA对人皮肤鳞癌细胞株(A431)NET-1和Survivin基因的抑制作用以及对细胞增殖、凋亡的影响。方法:构建siRNA NET-1、siRNA Survivin以及同时靶向NET-1和Survivin基因的一链双靶siRNA。采用免疫共沉淀法检测NET-1和Survivin蛋白在A431人皮肤鳞癌细胞中的相互作用。将A431细胞分为siRNA-NET-1组、siRNA-Survivin组、siRNA-NET-1&Survivin组、siRNA-NC组和control组,分别进行细胞转染。qRT-PCR和Western Blot法分别检测细胞内NET-1、Survivin mRNA和蛋白表达,细胞免疫荧光法观察NET-1、Survivin蛋白在细胞内的表达及定位。CCK-8法和流式细胞仪分别检测细胞增殖与凋亡情况。结果:免疫共沉淀法证实NET-1和Survivin蛋白有相互作用。qRT-PCR和Western Blot结果显示,siRNA-NET-1&Survivin组、siRNA-NET-1组和siRNA-Survivin组细胞中NET-1和Survivin mRNA和蛋白表达水平均低于siRNA-NC组及control组,siRNA-NET-1&Survivin组低于siRNA-NET-1组和siRNA-Survivin组,差异均有统计学意义(P<0.05)。CCK-8法检测显示,siRNA-NET-1&Survivin组、siRNA-NET-1组和siRNA-Survivin组细胞增殖水平低于siRNA-NC组和control组,siRNA-NET-1&Survivin组低于siRNA-NET-1组和siRNA-Survivin组,差异均有统计学意义(P<0.05)。流式细胞仪检测显示,siRNA-NET-1&Survivin组、siRNA-NET-1组和siRNA-Survivin组细胞凋亡率高于siRNA-NC组和control组,siRNA-NET-1&Survivin组高于siRNA-NET-1组和siRNA-Survivin组,差异均有统计学意义(P<0.05)。细胞免疫荧光显示,siRNA-NET-1&Survivin组、siRNA-NET-1组和siRNA-Survivin组NET-1和Survivin蛋白表达阳性细胞百分率低于control组,siRNA-NET-1&Survivin组低于siRNA-NET-1和siRNA-Survivin组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:NET-1和Survivin蛋白存在相互作用,靶向NET-1和Survivin的一链双靶siRNA能同时下调A431细胞NET-1和Survivin基因表达,并能抑制A431细胞增殖,促进细胞凋亡,一链双靶siRNA作用效果优于单靶siRNA。 展开更多
关键词 NET-1 SURVIVIN 一链双靶sirna A431 rna干扰 皮肤鳞状细胞癌
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Remodeling the tumor immune microenvironment via siRNA therapy for precision cancer treatment
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作者 Lingxi Jiang Yao Qi +8 位作者 Lei Yang Yangbao Miao Weiming Ren Hongmei Liu Yi Huang Shan Huang Shiyin Chen Yi Shi Lulu Cai 《Asian Journal of Pharmaceutical Sciences》 SCIE CAS 2023年第5期51-76,共26页
How to effectively transform the pro-oncogenic tumor microenvironments(TME)surrounding a tumor into an anti-tumoral never fails to attract people to study.Small interfering RNA(siRNA)is considered one of the most note... How to effectively transform the pro-oncogenic tumor microenvironments(TME)surrounding a tumor into an anti-tumoral never fails to attract people to study.Small interfering RNA(siRNA)is considered one of the most noteworthy research directions that can regulate gene expression following a process known as RNA interference(RNAi).The research about siRNA delivery targeting tumor cells and TME has been on the rise in recent years.Using siRNA drugs to silence critical proteins in TME was one of the most efficient solutions.However,the manufacture of a siRNA delivery system faces three major obstacles,i.e.,appropriate cargo protection,accurately targeted delivery,and site-specific cargo release.In the following review,we summarized the pharmacological actions of siRNA drugs in remolding TME.In addition,the delivery strategies of siRNA drugs and combination therapy with siRNA drugs to remodel TME are thoroughly discussed.In the meanwhile,the most recent advancements in the development of all clinically investigated and commercialized siRNA delivery technologies are also presented.Ultimately,we propose that nanoparticle drug delivery siRNA may be the future research focus of oncogene therapy.This summary offers a thorough analysis and roadmap for general readers working in the field. 展开更多
关键词 Small interfering rna Tumor microenvironment sirna delivery Cancer therapy CO-DELIVERY
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siRNA抑制丙型肝炎病毒IRES介导的基因表达 被引量:12
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作者 饶林 詹林盛 +1 位作者 彭剑淳 王全立 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第1期38-43,共6页
以HCVIRES为靶位 ,应用T7RNA多聚酶体外转录合成了 5条小干扰RNA(siRNA) .脂质体转染法将其导入HCVIRES介导萤光素酶表达的转基因细胞 (HepG2 .970 6 )中 ,通过测定萤光素酶的量 ,评价T7siRNA对HCV介导基因表达的抑制作用 .结果表明 ,... 以HCVIRES为靶位 ,应用T7RNA多聚酶体外转录合成了 5条小干扰RNA(siRNA) .脂质体转染法将其导入HCVIRES介导萤光素酶表达的转基因细胞 (HepG2 .970 6 )中 ,通过测定萤光素酶的量 ,评价T7siRNA对HCV介导基因表达的抑制作用 .结果表明 ,所合成的 5条T7siRNAs ,均能特异性地抑制萤光素酶基因的表达 ,抑制率分别为 94 31%、80 0 1%、78 0 1%、80 33%、85 6 4% ,其中以靶向HCVIRES第二茎环结构的T7siRNA1抑制率最高 ,且对HCV基因的抑制作用有剂量依赖性 ,随T7siRNA1量的增加 ,抑制率逐渐增强 .siRNA抑制HCV基因的作用具有良好的特异性 ,改变其中 1个核苷酸即无显著抑制作用 . 展开更多
关键词 rna干涉 T7 sirna 萤光素酶 内部核糖体进入位点 丙型肝炎病毒
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siRNA敲除STAT3基因对结肠癌HCT116细胞侵袭的抑制 被引量:8
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作者 范钰 张尤历 +6 位作者 张宇川 吴莺 魏金文 程兆明 何亚龙 王银环 李华 《江苏大学学报(医学版)》 CAS 2007年第1期46-48,共3页
目的:了解RNA干扰沉默STAT3基因对结肠癌细胞侵袭的可能作用。方法:根据STAT3基因特点,设计合成STAT3小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),并转染人结肠癌细胞系HCT116后,采用RT-PCR检测STAT3mRNA,采用软琼脂集落培养试验检测癌细... 目的:了解RNA干扰沉默STAT3基因对结肠癌细胞侵袭的可能作用。方法:根据STAT3基因特点,设计合成STAT3小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),并转染人结肠癌细胞系HCT116后,采用RT-PCR检测STAT3mRNA,采用软琼脂集落培养试验检测癌细胞锚着不依赖性增殖,采用Boyden小室模型试验检测癌细胞的侵袭能力。结果:STAT3 siRNA可有效抑制结肠癌细胞集落生长和侵袭能力,且与浓度相关。结论:STAT3 siRNA可抑制结肠癌细胞的侵袭。 展开更多
关键词 结肠肿瘤 STAT3 rna干扰 sirna 侵袭
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siRNA阻断NF-κB信号通路对食管鳞癌细胞增殖、耐药的影响 被引量:8
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作者 田芳 田卫红 +2 位作者 许培荣 刘红涛 薛乐勋 《郑州大学学报(医学版)》 CAS 北大核心 2007年第1期41-44,共4页
目的:通过RNA干扰(RNAi)阻断食管鳞癌细胞中NF-κB信号通路,研究其与肿瘤细胞增殖、耐药的关系。方法:使用NF-κB p65 siRNA分别转染人食管鳞癌Eca109和EC9706细胞72h,以未转染的Eca109和EC9706细胞为对照,采用Western blot检测p65蛋白... 目的:通过RNA干扰(RNAi)阻断食管鳞癌细胞中NF-κB信号通路,研究其与肿瘤细胞增殖、耐药的关系。方法:使用NF-κB p65 siRNA分别转染人食管鳞癌Eca109和EC9706细胞72h,以未转染的Eca109和EC9706细胞为对照,采用Western blot检测p65蛋白的表达;MTT法检测转染NF-κBp65siRNA24h、48h、72h后Eca109和EC9706细胞的增殖情况及转染同时联合应用不同质量浓度5-Fu(0mg/L,16.35mg/L,32.7mg/L,327mg/L,3270mg/L,6540mg/L)对Eca109和EC9706细胞增殖的影响。结果:①NF-κB亚单位p65在Eca109和EC9706细胞质中高表达,p65siRNA可有效阻断p65蛋白表达。②MTT实验表明,转染组细胞存活率较未转染组明显下降(P<0.05);与化疗药5-Fu联用,转染组和未转染组细胞的增殖活性随着5-Fu浓度的增加有下降趋势,但在同一浓度,转染p65siRNA的细胞与未转染组相比,细胞增殖活性明显下降(P<0.05)。结论:应用RNAi技术可有效干扰p65的表达,抑制食管鳞癌细胞的增殖,增强对化疗药5-Fu的敏感性。因此,可将阻断NF-κB信号通路作为基因治疗的靶点。 展开更多
关键词 食管肿瘤 NF-KAPPAB rna干扰 sirna
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软骨肉瘤相关基因Sox9(siRNA)表达质粒的构建鉴定以及对肿瘤细胞生长和凋亡的影响 被引量:5
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作者 秦宏敏 韩会峰 +3 位作者 沙广钊 刘林 彭易根 任天成 《中国肿瘤临床》 CAS CSCD 北大核心 2008年第3期158-161,共4页
目的:利用小干扰阻断目的基因的原理将构建的目的基因Sox9的pSilencer3,1-H1 neo siRNA(small interfering RNA)表达质粒转染人体软骨肉瘤细胞HTB-94,观察目的基因被阻断后肿瘤细胞目的基因的表达、肿瘤细胞生长和凋亡所受到的影响。方... 目的:利用小干扰阻断目的基因的原理将构建的目的基因Sox9的pSilencer3,1-H1 neo siRNA(small interfering RNA)表达质粒转染人体软骨肉瘤细胞HTB-94,观察目的基因被阻断后肿瘤细胞目的基因的表达、肿瘤细胞生长和凋亡所受到的影响。方法:设计并合成Sox9(siRNA),鉴定后将其转染HTB-94肿瘤细胞,观察肿瘤细胞的Sox9基因的mRNA和蛋白表达的变化,以及被转染肿瘤细胞的生长曲线和肿瘤细胞凋亡的情况。结果:Sox9(siRNA)的插入片段测序结果与合成的siRNA结果一致,被转染的HTB-94Sox9基因的mRNA的表达量下降了35.4%,蛋白的表达量下降了31.3%;Sox9(siRNA)转染HTB-94细胞24h和96h的光吸收值分别为0.146±0.037和0.412±0.036,而正常对照细胞组两个同样时间段的光吸收值分别为0.152±0.0367和0.607±0.029。其中细胞生长增殖速度的差异为32.0%,肿瘤细胞的生长明显受到抑制;Sox9(siRNA)转染HTB-94细胞的干扰组细胞凋亡率为39.2%;而未经干扰的HTB-94肿瘤细胞的细胞凋亡率为0.1%。结论:经过设计合成的Sox9(siRNA)表达质粒可以稳定转染人体软骨肉瘤细胞HTB-94肿瘤细胞,被Sox9(siRNA)表达质粒转染的人体软骨肉瘤细胞HTB-94肿瘤细胞Sox9基因的mRNA和蛋白的表达都受到抑制,同时肿瘤细胞的生长繁殖也受到明显抑制,肿瘤细胞的凋亡明显增加。 展开更多
关键词 sirna(Sox9) rna干扰 Sox9蛋白和 mrna表达 细胞生长曲线 细胞凋亡
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慢病毒介导uPA-siRNA重组表达载体的构建及促进兔软骨细胞增殖 被引量:5
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作者 史晨辉 王维山 +3 位作者 李长俊 张振东 郭风劲 陈安民 《基础医学与临床》 CSCD 北大核心 2014年第5期602-609,共8页
目的构建筛选出靶向特异uPA-siRNA慢病毒表达载体,感染软骨细胞后观察其对软骨细胞增殖及代谢的影响。方法根据siRNA原理设计、构建4对靶向兔uPA siRNA序列(P1、P2、P3和P4),用RT-PCR筛选出高效靶向的P2序列。各序列经慢病毒包装后,通过... 目的构建筛选出靶向特异uPA-siRNA慢病毒表达载体,感染软骨细胞后观察其对软骨细胞增殖及代谢的影响。方法根据siRNA原理设计、构建4对靶向兔uPA siRNA序列(P1、P2、P3和P4),用RT-PCR筛选出高效靶向的P2序列。各序列经慢病毒包装后,通过Lipofectamine 2000转染入兔软骨细胞后,用RT-PCR和Western blot法分别检测uPA-siRNA对细胞内uPA mRNA和蛋白表达水平的抑制效果,用CCK-8法检测uPA-siRNA对软骨细胞增殖的影响。结果成功构建4对uPA-siRNA序列并筛选出用于后续实验的高效靶向P2序列,各序列经慢病毒载体包装并成功转染到原代软骨细胞中,在感染复数(MOI)为100时感染率达到85%以上。P1、P2、P3和P4均可抑制软骨细胞中uPA基因及蛋白的表达,但P2沉默效果最好,基因抑制率达到70%,感染后软骨细胞的增殖受到促进。结论成功构建高效靶向uPA-siRNA慢病毒载体,证实其可稳定转染软骨细胞并高效抑制uPA基因表达并促进软骨细胞增殖。 展开更多
关键词 sirna rna干扰 慢病毒载体 软骨细胞 增殖
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hTERT-siRNA表达载体的构建及对MCF-7细胞生长、端粒酶活性的抑制作用 被引量:5
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作者 张志宏 曾永秋 +3 位作者 税青林 田强 黄燕 赵小平 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第6期561-564,共4页
目的构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的RNA干扰(RNAi)表达载体,并研究该载体对乳腺癌MCF-7细胞端粒酶活性及细胞增殖的影响,为针对端粒酶的乳腺癌基因治疗提供新的途径。方法设计针对人端粒酶逆转录酶催化亚基(hTERT)的干扰靶序列TGTTC... 目的构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的RNA干扰(RNAi)表达载体,并研究该载体对乳腺癌MCF-7细胞端粒酶活性及细胞增殖的影响,为针对端粒酶的乳腺癌基因治疗提供新的途径。方法设计针对人端粒酶逆转录酶催化亚基(hTERT)的干扰靶序列TGTTCAGCGTGCTCAACTA,构建重组siRNA表达质粒pGenesil-hTERT,同时构建不针对任何基因的阴性对照重组pGenesil-HK。两种重组质粒经酶切、电泳分析和测序鉴定后,用脂质体转染法分别转染乳腺癌MCF-7细胞,应用端粒酶重复序列扩增聚合酶链反应(TRAP-PCR)及聚丙烯酰胺凝胶电泳检测端粒酶活性,流式细胞仪测定细胞凋亡率。结果酶切电泳测序分析表明插入序列正确,重组质粒构建成功。转染pGenesil-hTERT的MCF-7细胞,凝胶电泳见端粒酶特征性条带明显减少,端粒酶活性受到明显抑制;pGenesil-hTERT转染细胞后凋亡率较对照组明显升高(P<0.01),且转染48h凋亡率最高,达54.7%±2.41%。结论hTERT-siRNA可有效抑制乳腺癌MCF-7细胞端粒酶活性、促进细胞凋亡,此法有望应用于肿瘤基因治疗。 展开更多
关键词 rna干扰 sirna表达载体 基因 hTERT 细胞凋亡
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猪杀菌/通透性增加蛋白基因siRNA载体构建及干扰效果评价 被引量:3
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作者 吴正常 殷学梅 +4 位作者 夏日炜 孙寿永 朱国强 吴圣龙 包文斌 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第3期491-496,共6页
本研究旨在构建并筛选猪(Sus scrofa)BPI基因的高效siRNA干扰载体,为在细胞水平上研究猪BPI基因的功能和作用机制提供基础。参照猪BPI基因(GenBank登录号:EF436278)全长编码区序列,设计其特异性发夹siRNA干扰片段,并将其克隆插入pcDNA 6... 本研究旨在构建并筛选猪(Sus scrofa)BPI基因的高效siRNA干扰载体,为在细胞水平上研究猪BPI基因的功能和作用机制提供基础。参照猪BPI基因(GenBank登录号:EF436278)全长编码区序列,设计其特异性发夹siRNA干扰片段,并将其克隆插入pcDNA 6.2-GW/EmGFPmiR干扰载体中,构建猪BPI基因4个干扰siRNA表达载体RB1、RB2、RB3和RB4,1个阴性对照NC,并通过PCR和测序进行验证,构建成功后转染猪小肠上皮细胞IPEC-J2并检测其干扰效率。结果发现,所构建的4个特异性siRNA载体均可显著降低猪BPI基因mRNA表达(P<0.05),其中RB4载体干扰效果最好,其干扰效率达到69%。本研究成功筛选可靶向干扰猪BPI基因的高效siRNA,为今后在细胞水平进一步研究BPI基因对猪肠道革兰阴性菌感染抗性的作用及其机制奠定了试验基础。 展开更多
关键词 BPI基因 sirna载体 rna干扰
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siRNA阻断NF-κB信号通路抑制宫颈癌HeLa229细胞的增殖及侵袭 被引量:4
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作者 田卫红 田芳 +2 位作者 许培荣 刘红涛 薛乐勋 《基础医学与临床》 CSCD 北大核心 2008年第10期1044-1047,共4页
目的通过RNA干扰阻断宫颈癌HeLa229细胞中NF-κB信号通路,研究其与肿瘤细胞增殖、耐药和侵袭力的关系。方法利用RNAi技术,将HeLa229分为转染组和对照组,MTT法检测细胞增殖,Boyden chamber体外侵袭实验检测细胞体外侵袭力。结果MTT实验表... 目的通过RNA干扰阻断宫颈癌HeLa229细胞中NF-κB信号通路,研究其与肿瘤细胞增殖、耐药和侵袭力的关系。方法利用RNAi技术,将HeLa229分为转染组和对照组,MTT法检测细胞增殖,Boyden chamber体外侵袭实验检测细胞体外侵袭力。结果MTT实验表明,转染组细胞存活率比对照组明显下降,联合应用化疗药,转染组和对照组细胞的存活率均随着5-Fu浓度的增加而下降,但在同一浓度,siRNA与5-Fu联合应用可明显提高HeLa229细胞对化疗药的敏感性。体外侵袭实验结果表明,和对照组相比,转染P65siRNA组穿越Matrigel胶的细胞数明显减少(P<0.05)。结论应用RNAi技术可有效阻断NF-κB信号通路,抑制宫颈癌细胞的增殖和体外侵袭力,增强对5-Fu的敏感性。因此,可将NF-κB信号通路作为宫颈癌基因治疗的靶点。 展开更多
关键词 宫颈癌 NF-KAPPAB rna干扰 sirna
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鞘内注射针对Toll样受体4基因的siRNA缓解坐骨神经结扎大鼠的神经病理性疼痛 被引量:4
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作者 吴飞翔 缪雪蓉 +2 位作者 徐学武 孙玉明 俞卫锋 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期377-381,共5页
目的观察坐骨神经结扎(CCI)大鼠鞘内注射针对Toll样受体4基因(TLR4)的siRNA(TLR4-siRNA)的镇痛作用及对脊髓TLR4、IL-1β、TNF-α表达的影响。方法大鼠随机分为4组(每组10只):假手术组、CCI组(鞘内注射生理盐水)、错配siRNA组(鞘内注射... 目的观察坐骨神经结扎(CCI)大鼠鞘内注射针对Toll样受体4基因(TLR4)的siRNA(TLR4-siRNA)的镇痛作用及对脊髓TLR4、IL-1β、TNF-α表达的影响。方法大鼠随机分为4组(每组10只):假手术组、CCI组(鞘内注射生理盐水)、错配siRNA组(鞘内注射错配siRNA)及siRNA-TLR4组(鞘内注射TLR4-siRNA)。后3组大鼠均行右侧坐骨神经结扎术,并行L5~L6鞘内置管;假手术组仅暴露坐骨神经而不结扎。TLR4-siRNA组大鼠从CCI术前1 d开始鞘内注射脂质体包裹的有效TLR4-siRNA(10μg/30μl),连续7 d;CCI组、错配siRNA组分别注射等量生理盐水和错配siRNA。采用热辐射及von Frey测痛丝分别测定各组大鼠的热痛阈及机械性痛阈;采用实时定量RT-PCR法观察各组大鼠脊髓组织TLR4 mRNA的表达;采用ELISA法测各组大鼠脊髓组织炎症因子IL-1β、TNF-α的含量。结果与假手术组相比,坐骨神经结扎后,大鼠热痛阈及机械性痛阈降低,脊髓TLR4 mRNA表达量增加,脊髓组织IL-1β、TNF-α的含量也增加(P<0.05)。与生理盐水组及错配siRNA组相比,鞘内注射TLR4-siRNA可抑制坐骨神经结扎引起的热痛觉过敏及机械性异常性疼痛(结扎后1、3、7 d,P<0.05),降低脊髓TLR4 mRNA表达(P<0.05),降低脊髓IL-1β、TNF-α含量(P<0.05)。结论鞘内注射TLR4-siRNA可通过干扰大鼠脊髓TLR4基因表达抑制其信号通路下游炎症因子的水平,进而缓解坐骨神经结扎引起的神经病理性疼痛。 展开更多
关键词 TOLL样受体4 神经病理性疼痛 sirna 坐骨神经结扎 rna干扰 白介素1Β 肿瘤坏死因子α
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PCR扩增的shRNA表达盒快速筛选PRRSV有效siRNA序列 被引量:3
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作者 贺云霞 华荣虹 +4 位作者 周艳君 安同庆 仇华吉 王云峰 童光志 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第5期376-380,共5页
有效siRNA的筛选是RNAi研究的关键点之一。本研究选取猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的核衣壳蛋白(N)作为靶基因,使用http://www.ambion.com的靶位点筛选和设计工具,选取4个siRNA序列(siRNA95、siRNA179、siRNA218和siRNA294),利用一步... 有效siRNA的筛选是RNAi研究的关键点之一。本研究选取猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的核衣壳蛋白(N)作为靶基因,使用http://www.ambion.com的靶位点筛选和设计工具,选取4个siRNA序列(siRNA95、siRNA179、siRNA218和siRNA294),利用一步PCR法产生包含U6启动子的短发夹RNA表达盒技术快速筛选高效siRNA,PCR法制备的shRNA表达盒(PCR-shRNA95、PCR-shRNA179、PCR-shRNA218和PCR-shRNA294)分别与表达N-EGFP融合蛋白的重组质粒pEN-ORF7共转染至293T细胞,48 h后荧光显微镜下检测细胞表达EGFP阳性率,筛选有效siRNA片段,将筛选的PCR-shRNA179的PCR产物转染N-EGFP融合蛋白稳定表达293T细胞系和PRRSV感染的Marc-145细胞,结果表明PCR-shRNA179可明显减少N蛋白的表达、有效减轻PRRSV引起的细胞病变及减少感染PRRSV的Marc-145细胞中的N蛋白阳性细胞。本研究证明一步PCR扩增shRNA表达盒法可用于筛选特异性基因表达抑制的siRNA。 展开更多
关键词 rna干扰 sirna 短发夹rna(shrna) 猪繁殖与呼吸综合征病毒
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HPV-16 E6 siRNA与hIL-24基因联合诱导人宫颈癌Ca Ski细胞的凋亡 被引量:3
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作者 石华 杨俊霞 +5 位作者 袁成福 易发平 魏丽丽 刘革力 马永平 宋方洲 《肿瘤》 CAS CSCD 北大核心 2007年第5期348-351,共4页
目的:观察HPV-16 E6 siRNA与hIL-24基因体外共转染,联合诱导人宫颈癌Ca Ski细胞凋亡的效应。方法:HPV-16 E6 siRNA与hIL-24基因的质粒载体分别以单独或联合的方式转染人宫颈癌Ca Ski细胞,随后利用RT-PCR技术检测细胞中HPV-16 E6癌基因的... 目的:观察HPV-16 E6 siRNA与hIL-24基因体外共转染,联合诱导人宫颈癌Ca Ski细胞凋亡的效应。方法:HPV-16 E6 siRNA与hIL-24基因的质粒载体分别以单独或联合的方式转染人宫颈癌Ca Ski细胞,随后利用RT-PCR技术检测细胞中HPV-16 E6癌基因的mRNA水平变化;Western blot分析细胞中抑癌蛋白p53水平的变化;流式细胞技术分析细胞凋亡情况。结果:经HPV-16 E6 siRNA和hIL-24转染后细胞后HPV E6癌基因的mRNA水平均下降,其中联合转染组显著下降(P<0.05);抑癌蛋白p53水平均增高,其中联合转染组显著增高,细胞凋亡率均升高,其中联合转染组显著升高(P<0.05)。结论:HPV-16 E6 siRNA与hIL-24基因分别转染宫颈癌Ca Ski细胞后,均能抑制Ca Ski细胞中HPV-16 E6癌基因的表达,使抑癌蛋白p53恢复活性,诱导宫颈癌Ca Ski细胞凋亡;两者联合则具有协同效应,能显著提高肿瘤细胞凋亡率。 展开更多
关键词 宫颈肿瘤 rna 小分子干扰 凋亡 基因 HPV-16 E6 sirna 基因 hIL-24 CA Ski细胞
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siRNA制备技术的研究进展 被引量:12
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作者 张中华 侯永泰 《生命科学》 CSCD 2004年第4期231-235,199,共6页
近年来,siRNA(smallinterferingRNA)被广泛用于诱导哺乳动物体系中的RNA干扰。目前有五种siRNA制备方法化学合成法、体外转录法、RNaseⅢ家族体外消化法、表达载体法和表达框架法。在这些方法中siRNA序列的选择至关重要。随着药物研究... 近年来,siRNA(smallinterferingRNA)被广泛用于诱导哺乳动物体系中的RNA干扰。目前有五种siRNA制备方法化学合成法、体外转录法、RNaseⅢ家族体外消化法、表达载体法和表达框架法。在这些方法中siRNA序列的选择至关重要。随着药物研究和基因组研究的进展,siRNA的制备技术需要在高通量筛选、稳定性、基因导入和调控等方面进一步发展与完善。作者综述了siRNA序列的选择原则和哺乳动物系统中的siRNA产生方法,并简要讨论了其发展前景。 展开更多
关键词 sirna制备 sirna SHrna rna干扰
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烟草花叶病毒siRNA设计及其植物表达载体构建(英文) 被引量:2
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作者 马欣荣 谈心 +1 位作者 刘华玲 张义正 《应用与环境生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期151-154,共4页
RNA干扰技术已广泛应用于沉默基因表达的研究.本文分析烟草花叶病毒(TMV)基因序列,选择设计编码小分子发卡结构RNA(hpRNA)的cDNA;并根据农杆菌双元载体质粒p2355多克隆位点区限制性酶切位点,两端分别加入XbaI和BamHI酶切位点;分别合成单... RNA干扰技术已广泛应用于沉默基因表达的研究.本文分析烟草花叶病毒(TMV)基因序列,选择设计编码小分子发卡结构RNA(hpRNA)的cDNA;并根据农杆菌双元载体质粒p2355多克隆位点区限制性酶切位点,两端分别加入XbaI和BamHI酶切位点;分别合成单链DNA复性后插入到p2355上,经PCR、测序验证,表明已成功构建了具有潜在表达烟草花叶病毒siRNA的植物表达载体. 展开更多
关键词 rna干扰(rnaI) 发卡rna(hprna) 小分子干扰rna(sirna) 烟草花叶病毒(TMV) 植物表达载体
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单纯疱疹病毒1型US12基因siRNA筛选及其对病毒增殖的影响 被引量:2
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作者 李深 任哲 +7 位作者 王巧利 向阳飞 王一飞 胡巢凤 戚仁斌 陆大祥 张庶民 张佩琢 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第3期528-532,共5页
目的:筛选高效沉默单纯疱疹病毒1型(HSV-1)US12基因的siRNA,研究siRNA沉默US12基因后对HSV-1增殖的影响。方法:构建pEGFP-N1-US12融合表达质粒,设计并化学合成3对靶向US12基因的siRNA,与pEGFP-N1-US12融合表达质粒共转染Vero细胞,流式... 目的:筛选高效沉默单纯疱疹病毒1型(HSV-1)US12基因的siRNA,研究siRNA沉默US12基因后对HSV-1增殖的影响。方法:构建pEGFP-N1-US12融合表达质粒,设计并化学合成3对靶向US12基因的siRNA,与pEGFP-N1-US12融合表达质粒共转染Vero细胞,流式细胞术筛选高效抑制pEGFP-N1-US12融合蛋白的siRNA,实时荧光定量PCR检测siRNA对细胞内US12 mRNA表达水平的抑制效果,空斑减数实验评价siRNA对HSV-1增殖的抑制效果。结果:共转染实验筛选出高效抑制pEGFP-N1-US12融合蛋白的siR-NAS121、siRNAS122及siRNAS123。3对siRNA均能显著降低感染细胞US12 mRNA的表达水平,但空斑减数实验均未发现3对siRNA对HSV-1的增殖有显著抑制效果。结论:成功构建pEGFP-N1-US12融合表达质粒,筛选到高效抑制US12基因表达的3对siRNA,但是对病毒的体外增殖无显著影响,表明US12表达的立即早期蛋白ICP47的功能可能与HSV-1体外增殖无直接相关。 展开更多
关键词 sirna rna干扰 基因 US12 单纯疱疹病毒1型
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Survivin基因siRNA表达载体的构建及其在食管癌EC109细胞中的表达 被引量:5
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作者 李维青 郑建 +1 位作者 刘桐林 李简 《中国现代医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第8期1192-1194,1202,共4页
目的为研究survivin基因的功能及食管癌的基因治疗,构建针对survivin基因的siRNA的表达载体,转染细胞EC109后观察其对survivin基因表达的抑制作用。方法利用网站选择适当位点设计并合成针对survivin基因mRNA的寡核苷酸序列,插入质粒pBAs... 目的为研究survivin基因的功能及食管癌的基因治疗,构建针对survivin基因的siRNA的表达载体,转染细胞EC109后观察其对survivin基因表达的抑制作用。方法利用网站选择适当位点设计并合成针对survivin基因mRNA的寡核苷酸序列,插入质粒pBAsi-hU6中形成重组载体pBAsi-survivin。重组载体经测序鉴定后转染食管癌细胞EC109,westernblot检测转染前后survivin蛋白的表达情况。结果测序结果与所合成的寡核苷酸完全一致,证实成功构建了针对survivin基因的siRNA表达载体。Westernblot检测显示转染食管癌细胞EC109后有效抑制了survivin基因的表达。结论针对surivivin基因的siRNA表达载体成功构建,并能有效抑制食管癌细胞EC109中survivin基因的表达。 展开更多
关键词 载体构建 食管癌 sirna rna 干扰survivin
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KDR为靶的siRNA抑制乳腺癌细胞增殖的体内外研究 被引量:13
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作者 张晓静 葛银林 +1 位作者 侯琳 李泉 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第1期58-61,共4页
目的:采用化学修饰的小干扰RNA(siRNA)在体内外抑制含激酶插入区受体(KDR)基因表达,探讨化学修饰的siRNA介导的RNA干扰(RNA i)技术在乳腺癌基因治疗的可行性和特异性。方法:采用阳离子脂质体L ipofectam ine2000TM作为转染试剂将针对人... 目的:采用化学修饰的小干扰RNA(siRNA)在体内外抑制含激酶插入区受体(KDR)基因表达,探讨化学修饰的siRNA介导的RNA干扰(RNA i)技术在乳腺癌基因治疗的可行性和特异性。方法:采用阳离子脂质体L ipofectam ine2000TM作为转染试剂将针对人KDR基因的siRNA转染人类乳腺细胞株MCF-7,诱导RNA i,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法,RT-PCR,Western blot试验等检测KDR基因和蛋白表达及细胞增殖变化。采用阳离子聚合物纳米粒In vivojetPEITM为转染试剂将siRNA直接注射进裸鼠移植瘤,监测肿瘤生长变化,RT-PCR,免疫组化方法等监测KDR基因和蛋白表达变化。结果:靶向KDR基因siRNA转染MCF-7后,细胞增殖被抑制,KDRmRNA和蛋白的表达明显降低;裸鼠体内实验显示siRNA治疗组瘤组织的增长受到明显抑制;RT-PCR,免疫组化结果同时表明治疗组KDR表达下调。各对照组指标无明显变化。结论:化学修饰的siRNA介导的RNAi在体内外均能成功抑制靶基因的表达和MCF-7细胞增殖,是潜在的肿瘤治疗新方法,而KDR亦可作为肿瘤治疗的新靶点。 展开更多
关键词 rna干扰 sirna MCF-7细胞 血管内皮生长因子受体2 基因治疗
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Bcl-2 siRNA抑制HL-60细胞bcl-2基因表达 被引量:3
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作者 雷小勇 燕春艳 +3 位作者 涂玉林 钟苗 冯兰芳 廖端芳 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第12期1445-1450,共6页
目的应用RNA干扰技术观察Bcl2siRNA对白血病细胞HL60中bcl2基因表达的影响,探讨siRNA技术在白血病治疗中的作用。方法利用化学合成法体外化学合成Bcl2siRNA,将Bcl2siRNA与HL60细胞共孵育,用MTT法、荧光染色观察细胞增殖及凋亡情况,用RT... 目的应用RNA干扰技术观察Bcl2siRNA对白血病细胞HL60中bcl2基因表达的影响,探讨siRNA技术在白血病治疗中的作用。方法利用化学合成法体外化学合成Bcl2siRNA,将Bcl2siRNA与HL60细胞共孵育,用MTT法、荧光染色观察细胞增殖及凋亡情况,用RTPCR检测Bcl2mRNA水平,用荧光染色测Bcl2蛋白水平。结果Bcl2siRNA与HL60细胞共孵育48h后,HL60细胞凋亡率增加,Bcl2mRNA水平下调,Bcl2蛋白表达水平降低。转染GAPDHsiRNA组的细胞对Bcl2表达无影响。结论Bcl2siRNA能够特异性降低Bcl2mRNA水平及蛋白质的表达,促进HL60细胞凋亡。 展开更多
关键词 rna干扰 BCL-2 sirna HL-60
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