利用CRISPR/Cas9系统建立长链非编码RNA SNHG1基因敲除细胞系并研究其功能

目的利用CRISPR/Cas9介导的同源定向修复机制构建长链非编码RNA(lncRNA)核仁小分子RNA宿主基因1(SNHG1)稳定敲除的A549细胞系,并进行功能研究。方法设计靶向SNHG1基因的小向导RNA(sgRNA),将其克隆到LentiCRISPR v2质粒中,构建Cas9‐sgSNHG1质粒。以A549细胞基因组DNA为模板,PCR扩增5′同源臂(5′Arm)和3′同源臂(3′Arm)序列,以pEGFP‐Blast质粒为模板,PCR扩增pEGFP‐Blast‐polyA序列;利用重叠PCR将3个序列连接为5′Arm‐pEGFP‐Blast‐polyA‐3′Arm,通过Gibson克隆将其连接到pUC18质粒上,构建SNHG1同源重组模板质粒。将构建成功的两个重组质粒共转染A549细胞,用杀稻瘟菌素(Blast)筛选稳定插入pEGFP‐Blast‐polyA的细胞株,挑取单克隆。实时荧光定量PCR(qPCR)检测敲除效率,CCK‐8法和克隆形成实验检测细胞增殖活力及克隆形成能力。结果成功构建Cas9‐sgSNHG1及SNHG1同源重组模板质粒,筛选获得敲除效率较高的A549细胞系,发现敲除SNHG1可抑制A549细胞增殖活力及克隆形成能力。结论SNHG1稳定敲除的A549细胞系构建成功,SNHG1的癌基因功能受到显著抑制。CRISPR/Cas9介导的同源定向修复可有效抑制长链非编码RNA的表达,是长链非编码RNA功能研究的重要工具。