基于AutoDock Vina筛选徐长卿抑制尖吻蝮蛇毒金属蛋白酶有效组分的研究

目的基于分子对接方法筛选徐长卿抑制尖吻蝮蛇毒金属蛋白酶的有效组分。方法使用AutoDock Vina软件对徐长卿[Cynanchum paniculatum(Bunge)Kitag]中化合物与尖吻蝮蛇(Deinagkistrodon acutus)蛇毒金属蛋白酶进行分子对接,采用ADMET对较高结合能组分进行毒性分析,筛选有效抑制组分。结果与阳性对照穿心莲内酯的对接结合能比较,从徐长卿中筛选出17种具有较高结合能的化合物。通过SwissADME预测毒性,确定10种潜在的无毒性化合物,分别为Cinatratoside B、Paniculatumoside D、Glacoside A、Cynapanoside A、Paeonolide、Paniculatumoside A、Cynatratoside A、Paniculatumoside B、GreenOil、1,6-Dimethylnaphthalene。结论基于AutoDock Vina虚拟筛选,从徐长卿中筛选出10种具有潜在抑制尖吻蝮蛇毒金属蛋白酶活性的化合物。

尖吻蝮蛇蛇毒金属蛋白酶cDNA序列抗原位点分析及免疫保护效果观察

目的采用生物信息学方法分析尖吻蝮蛇蛇毒金属蛋白酶cDNA序列的关键抗原位点,并观察根据这些位点设计合成的新型免疫原的免疫保护效果。方法扩增尖吻蝮蛇蛇毒金属蛋白酶cDNA序列,采用Jameson-Wolf方法和ClustalX软件结合的生物信息学方法分析其抗原位点,人工合成筛选的抗原位点序列,并连接到pIRESneo表达载体,3次(0、2、4周)对BALB/c小鼠进行核酸免疫,ELISA法测定免疫后机体抗体水平,出血中和实验和攻毒实验初步观察其免疫保护效果。结果生物信息学方法分析得到6个关键抗原位点(MPA-1～MPA-6);ELISA法检测抗血清结果表明,抗原位点序列诱导小鼠产生的抗血清相对未免疫的小鼠血清稀释100倍后仍能表现出阳性结果;出血中和实验和攻毒实验表明,将抗原位点序列免疫小鼠可以诱导机体产生免疫反应,使体内产生抗体,能有效中和蛇毒,从而对尖吻蝮蛇蛇毒引起的出血有防护作用。结论用生物信息学方法成功获得尖吻蝮蛇蛇毒金属蛋白酶cDNA序列的6个关键抗原位点,针对这些位点设计合成的新型免疫原展示出初步免疫保护效果。

墨旱莲对4种蝮蛇毒引起的炎症和出血的影响

目的探讨墨旱莲提取液对短尾蝮蛇毒、蛇岛蝮蛇毒、白眉蝮蛇毒及尖吻蝮蛇毒所致的炎症和出血的影响。方法应用短尾蝮蛇毒、蛇岛蝮蛇毒、白眉蝮蛇毒及尖吻蝮蛇毒所致大鼠足跖肿胀的致炎模型,观察墨旱莲提取液对蛇毒所致大鼠足跖肿胀的影响。墨旱莲提取液分别与不同蛇毒混合,给小鼠腹部皮下注射,观察其对蛇毒引起的小鼠皮下出血的影响。结果墨旱莲提取液15g/kg连续2次灌胃给药,对短尾蝮蛇毒、蛇岛蝮蛇毒、白眉蝮蛇毒或尖吻蝮蛇毒所致大鼠足跖肿胀的急性炎症造模和短尾蝮蛇毒棉球肉芽肿的慢性炎症造模(20g/kg)均有明显的抑制作用,对这些蛇毒引起的小鼠皮下出血也能明显抑制。结论墨旱莲提取液对短尾蝮蛇毒、蛇岛蝮蛇毒、白眉蝮蛇毒及尖吻蝮蛇毒引起的炎症和出血均有明显的抑制作用。

圈养尖吻蝮雌体大小、窝卵数和卵大小之间的关系

尖吻蝮(Deinagkistrodon acutus)野生资源日益枯竭,食用和药用压力巨大,亟需开展人工养殖。目前尖吻蝮的人工养殖技术还不够成熟,大多数养殖场采用半地下室饲养尖吻蝮,有关该条件下尖吻蝮的繁殖特性报道较少。为促进尖吻蝮的人工养殖,2010年4—9月,在湖南永州市对半地下室圈养的尖吻蝮成体的体型指标、窝卵数、窝卵重、卵重等繁殖特征之间的关系进行了研究。结果表明:圈养尖吻蝮成年雌体产单窝柔性卵,平均窝卵数为23.0±7.8(13—37)枚(n=23);将产后雌体体重和窝卵重相加记为产前雌体体重,采用SPSS 13.0软件处理数据,设置α=0.05和α=0.01,发现产前雌体体重分别与窝卵数、窝卵重、卵重均呈显著相关性;产前雌体体长分别与窝卵数、窝卵重、卵重无显著相关性;窝卵数与卵重无显著相关性,卵重分别与卵短径、卵长径均呈显著相关性。产前体重在1000—1200 g之间的雌蛇所产窝卵数和单枚卵重的数值均较大且最集中,这保证了雌体繁殖输出后代的生存优势,对尖吻蝮人工养殖挑选雌性种蛇有一定的指导意义。

湖南永州尖吻蝮蛇蛇毒的蛋白组分及毒性分析

采用Nano–LC–ESI–MS/MS蛋白鉴定技术对湖南永州尖吻蝮蛇蛇毒蛋白组分进行质谱分析,应用常规体外试管法对尖吻蝮蛇蛇毒体外溶血值进行检测,采用改良寇式法对尖吻蝮蛇蛇毒LD50进行测定。结果显示:尖吻蝮蛇蛇毒含有50种蛋白,蛋白相对分子质量集中在1.0×104~2.0×104(46.9%)、4.0×104~5.0×104(22.4%)、2.0×104~3.0×104(10.6%)和7.0×104~8.0×104(7.6%),其中代表性的高丰度蛋白有蛇毒金属蛋白酶A(11.7%)、蛇毒金属蛋白酶H1(9.8%)、蕲蛇类凝血酶–2(7.3%)、抗凝血酶A–A亚基(6.8%),低丰度蛋白(<0.1%)有Ecto–5'–核苷酸酶、碱性磷脂酶A2 DAV–N6、生长分化因子11;蛇毒引起红细胞溶血的最低质量浓度为60.00μg/mL,尖吻蝮蛇蛇毒对KM小鼠的LD50为7.179 6 mg/kg,攻毒小鼠出现呼吸急促、躁动不安、注射部位出现奇特瘙痒和大面积溃烂,至死亡。

一种来自于尖吻蝮蛇毒的新类凝血酶对血液止血机制的研究

目的：研究尖吻蝮蛇蛇毒止血酶Agacutase的止血机制。方法：水蛭素、肝素、苯甲基磺酰氟（PMSF）、钙离子或尿素等分别与Agacutase酶混合,在体外研究它们对酶凝结活性的影响。新西兰白兔静脉注射Agacutase,观察新西兰白兔的血凝和纤溶指标。结果：水蛭素和肝素对该酶没有影响,PMSF和尿素明显抑制酶的凝结活性,而钙离子激活酶凝结活性。静脉注射Agacutase 0.03-0.12 U/kg剂量后,各组全血凝固时间与给药前相比均有不同程度的缩短,给药后2 h药效达高峰,药效持续24 h。与给药前比较,各组兔血纤维蛋白原含量和血黏度在给药后有不同程度的降低,这与血液凝固时间缩短一致,对活化部分凝血活酶时间（APTT）无影响。结论：Agacutase在血管内引起较高浓度的可溶性纤维蛋白,但不激活凝血因子II和XIII,在伤口部位加速止血。在正常的血管内,不会造成血栓形成。所有实验结果显示,Agacutase是一个有效的潜在止血剂。

尖吻蝮幼蛇就地和异地人工养殖研究

目的研究尖吻蝮(Deinagkistrodon acutus)幼蛇在人工养殖过程中的技术难关,探讨尖吻蝮幼蛇生长缓慢的原因,以提高幼蛇的成活率和生长率。方法采用湖南省永州市野生尖吻蝮种蛇产卵孵化的幼蛇,在原产地永州与非原产地广西南宁进行幼蛇的人工饲养对比实验,观察在不同地域人工饲养的尖吻蝮幼蛇的生长速度。结果尖吻蝮幼蛇在本地及异地人工饲养均获得成功,尤其以南宁人工饲养的幼蛇最为明显,2010年9月饲养至2011年8月,幼蛇均重从(13.8±1.8)g增长至(198.8±80.6)g,最重的个体体重达350 g。两地饲养的幼蛇均可自行捕食中华蟾蜍、老鼠及活小鸡、鸭苗,仅用1年时间将野生尖吻蝮子代幼蛇人工饲养成功。结论尖吻蝮幼蛇在本地及异地人工饲养是可行的。

单甘酯与蜂蜡复配制备五步蛇蛇油基凝胶油的研究

以五步蛇蛇油为基料油,通过向其添加不同质量比的蜂蜡与单甘酯制备凝胶油。探讨不同蜂蜡与单甘酯的质量比对五步蛇蛇油基凝胶油流变性、持油性以及硬度的影响,并对其结晶型态、结晶形状进行分析。结果表明:少量单甘酯的存在(蜂蜡与单甘酯质量比8∶2)降低了五步蛇蛇油基凝胶油的黏度恢复值及硬度,促进凝胶油长枝状结晶的生成,增加α、β以及β’型晶体;随着单甘酯比例的进一步增加(蜂蜡与单甘酯质量比8∶2~0∶10),五步蛇蛇油基凝胶油析油率和黏度恢复值增加,长枝状结晶逐渐变短至消失,α型晶体逐渐消失;确定蜂蜡与单甘酯质量比4∶6为最佳比例,此时五步蛇蛇油基凝胶油的析油率为1. 8%,硬度为242 g,黏度恢复值为37%。

蕲蛇酶抗小鼠实验性肿瘤转移作用研究

目的 探讨从尖吻蝮蛇毒中分离得到的具有凝血酶样酶活性的蕲蛇酶抗实验性肿瘤转移作用。 方法 用尾静脉注射体外培养的黑色素瘤 B1 6和肉瘤 S-1 80细胞的小鼠肺转移模型 ,注射瘤细胞前后分别腹腔注射药物 ,2 0天后处死小鼠 ,计数肺表面转移瘤结节数。 结果 蕲蛇酶剂量在 2～ 5AU/kg ip能明显减少 B1 6在 C57BL小鼠及 S-1 80在昆明鼠的肺转移结节数 ,但对转移瘤小鼠的生命无明显的延长作用。

降纤酶关键质量属性研究

目的:通过对降纤酶鉴别、纯度、分子量、等电点、N端序列、比活性6个方面关键质量属性的表征,为后续标准提高提供依据。方法:采用SDS-PAGE电泳法分析不同来源的蛇毒原料;采用紫外-可见分光光度法、SDS-PAGE电泳法、体积排阻色谱和反相超高效液相色谱法、基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱法、等电聚焦电泳法、“edman”N端测序法以及凝固法和生色底物法对不同企业提供的降纤酶进行测定和分析。结果:不同来源的尖吻蝮蛇蛇毒蛋白组成基本一致,尖吻蝮蛇蛇毒和白眉蝮蛇蛇毒蛋白质组成差异较大。降纤酶对苯甲酰-L-精氨酸甲酯盐酸盐最大吸收波长为247 nm,对苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐最大吸收波长为254 nm,但对苯甲酰-DL-精氨酰对硝基苯胺无水解作用。降纤酶能完全水解纤维蛋白原α肽链,活性受到苯甲基磺酰氟、二硫苏糖醇和对氨基苯甲醚的抑制。尺寸排阻高效液相色谱法降纤酶纯度测定结果高于反向超高效液相色谱法,前者为99.9%,后者为95.4%。SDS-PAGE电泳法测降纤酶完整分子量受标准品线性范围的影响,采用10~250 kDa范围的标准品点拟合,降纤酶完整分子量为(42.1±1.6)kDa;采用10~100 kDa范围的标准品点拟合,降纤酶分子量为(38.4±1.3)kDa。MALDI-TOF-MS法测得降纤酶完整分子量为(33.3±0.5)kDa,脱糖基分子量为(28.8±0.02)kDa。降纤酶pI值在3.0~4.0之间,N端序列为VIGGVECDINEHRFL。凝固法和生色底物法测比活性相关性显著(P<0.01),但凝固法结果高于生色底物法。结论:不同企业提供的降纤酶的6个方面的关键质量属性基本一致。现行降纤酶药品国家标准中鉴别、纯度、分子量等项目有待进一步增修订。

头面部五步蛇咬伤中毒1例

蛇咬伤每年致死、致残人数较多。头面部毒蛇咬伤较罕见,容易误诊漏诊,且致死率较高。本文报道头面部毒蛇咬伤中毒1例并文献回顾10例类似病例,归纳头面部毒蛇咬伤中毒的临床特点,为临床诊治提供指导。头面部毒蛇咬伤可能导致气道损伤、水肿,气道梗阻是早期死亡的主要原因,及时进行气管插管或气管切开以保持氧气供应,并尽早使用抗蛇毒血清有助于改善预后。

抗尖吻蝮蛇毒卵黄抗体口服给药保护剂的研究

【目的】比较硫糖铝和5种糖类对抗尖吻蝮蛇(Deinagkistrodon acutus)毒卵黄抗体(IgY)的保护作用,为开发抗尖吻蝮蛇毒IgY口服制剂提供依据。【方法】通过免疫白来航鸡(Gallus domesticus),从所产鸡蛋中制备抗尖吻蝮蛇毒IgY。在不同pH值(2.0,3.0)条件下,于IgY中加入相同剂量的保护剂,用ELISA法测定IgY活性;在pH值为2.0且加入条件下,加入等于或高于胃内正常质量浓度的胃蛋白酶,后加入不同剂量的硫糖铝,再用ELISA法测定IgY抗体活性;用不同剂量的保护剂与IgY混合后灌胃小鼠(Mus musculus),在不同时间点(1.5,2.5,3.5h)取血,采用ELISA和Western法测定血清中的IgY活性。【结果】在pH值为2.0和3.0条件下,硫糖铝对IgY抗体活性的保护效果均为最佳;在pH值为2.0且加入不小于胃内正常的胃蛋白酶质量浓度的条件下,体积分数在30%以上的硫糖铝均可提高IgY活性;IgY灌胃后的小鼠血清中,体积分数为50%的硫糖铝可有效保护IgY活性。【结论】加入硫糖铝作保护剂后能有效提高IgY对胃酸和胃蛋白酶的抵御作用。

尖吻蝮蛇毒药理作用的研究进展

目的:探讨尖吻蝮蛇毒的药理作用。方法:综述尖吻蝮蛇毒的化学成分、凝血作用、抗血栓作用、抗肿瘤机制及其他生理活性的最新研究进展。结果:研究表明尖吻蝮蛇毒在凝血、溶栓和肿瘤治疗中的应用越来越广泛,既有确切的疗效,又具有一定的不良反应。结论:对尖吻蝮蛇毒的化学成分及不良反应进行研究,观察其在人体内的代谢情况,提高其临床安全性和疗效仍将是今后重要的研究方向。

3种固定化尖吻蝮蛇毒金属蛋白酶的比较

【目的】筛选出一种最优的固定化尖吻蝮(Deinagkistrodon acutus)蛇毒金属蛋白酶(Snake venom metalloproteinase,SVMP)的方法。【方法】采用D380大孔树脂、海藻酸钠-壳聚糖、溶胶-凝胶等3种载体固定化SVMP,用分光光度法检测固定化金属蛋白酶和游离金属蛋白酶的酶活性,计算它们的酶搭载率、酶活回收率,并检验它们的温度耐受性、pH耐受性和重复使用性,并由此筛选出最优固定化方法。【结果】溶胶-凝胶固定化酶、海藻酸钠-壳聚糖固定化酶和D380大孔树脂固定化酶的酶搭载率分别为91.47%,78.14%和49.44%;D380大孔树脂固定化酶、海藻酸钠-壳聚糖固定化酶和溶胶-凝胶固定化酶的酶活回收率分别为39.00%,39.53%和41.17%;重复使用4次后,溶胶-凝胶固定化酶的酶活回收率最高;溶胶-凝胶固定化酶pH耐受性最优,对温度的耐受性也最高。【结论】溶胶-凝胶固载体固定尖吻蝮蛇SVMP的效果最优。