原矛头蝮蛇毒中一个新颖双链纤溶酶的分离纯化与性质研究

目的从原矛头蝮蛇毒中寻找新型纤溶酶,对其理化性质与生物学活性进行研究,以了解其在蛇伤中的作用与毒性机制,并评估其潜在的应用价值。方法采用蛋白层析技术分离纯化获得目标蛋白,检测其分子量、等电点、肽指纹图谱、多种蛋白水解活性、抗补体活性、出血活性、水肿活性及对流血时间的影响。结果通过阴离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析从原矛头蝮蛇毒中纯化出一个酸性纤溶酶PMSP-A,它是由两条等电点分别为5.7与6.1的非均等肽链共价结合而成。SDS-PAGE和凝胶过滤测定其分子量分别为26.1 ku与25.3 ku。肽指纹图谱分析表明PMSP-A与黄绿烙铁头蛇毒中的血液凝固结合因子有部分序列吻合。PMSP-A能够依次降解纤维蛋白原的Bβ、Aα链,该活性能被PMSF、1,10-phenanthroline抑制,EDTA、EGTA、SBTI不能抑制其活性。PMSP-A具有纤维蛋白、精氨酸酯水解活性,没有偶氮酪蛋白水解活性。它还具有抗补体活性。动物实验表明,PMSP-A明显延长小鼠尾静脉流血时间,能诱导小鼠足趾轻度水肿,无皮下出血活性。结论 PMSP-A是一个新颖的原矛头蝮蛇毒双链丝氨酸蛋白酶,具有多种影响机体的生物学活性。

C端序列的删除对非出血重组蛇毒纤溶酶的影响

【目的】研究C端序列对非出血重组纤溶酶(rFⅡ)特异性、活性和热敏感性的影响。【方法】通过SOEingPCR方法构建删除C端序列的突变体,突变体和rFⅡ分别在P.pastoris中诱导表达。表达和纯化的蛋白用SDS-PAGE和Westerenblot进行鉴定。之后分析其生化特性。【结果】rFⅡ及突变体通过SDS-PAGE和Westerenblot得到证实。生化分析揭示:①突变体对显色底物N-(p-Tosyl)-Gly-Pro-Lys-pNA的催化效率(Kcat/Km)是rFⅡ的1.9倍;②突变体和rFⅡ对氧化的胰岛素B链拥有共同的优先裂解位点,可是在随后的裂解中开始展现差异;③突变体显示了更高的纤(原)活性;④热处理表明突变体相较rFⅡ对温度的增加更敏感;⑤通过圆二色谱测量,突变体的螺旋比例有所增加。【结论】删除的序列参与rFⅡ的特异性、活性和热敏感性,该序列可作为下一步优化的候选序列。

重组蛇毒纤溶因子特异性相关突变体的构建、表达和纯化

目的通过重组蛇毒纤溶因子特异性相关突变体的构建、表达和纯化,初步考查其特异性变化。方法SOEingPCR方法构建突变体,突变体在P.pastoris酵母中诱导表达。表达蛋白经过柱纯化,纯化蛋白用SDS-PAGE和Westernblot鉴定,并用MALDI-TOF初步分析其作用于氧化胰岛素B链的特异性。结果SDS-PAGE和Westerenblot证实得到纯化的突变体。MALDI-TOF质谱分析揭示,rFⅡ及突变体对氧化胰岛素B链的早期裂解都发生在第12～13位点,但次级的裂解模式有所不同。结论删除的序列可能与rFⅡ的特异性相关。

蛇毒类抗血栓蛋白酶的研究进展

血栓栓塞性疾病严重威胁人类健康,研究具有优势的抗栓药物是当代医学的重点和热点之一。蛇毒中存在3类具有抗栓作用的蛋白酶,分别为蛇毒类凝血酶、纤维蛋白(原)溶解酶、纤溶酶原激活剂。对这3类抗血栓蛋白酶进行了综述,分别介绍了各类酶的分布、结构、生化性质以及作用机制,并结合其性质及机制分析在抗栓方面存在的优点和不足。另外,还介绍了蛇毒类抗血栓蛋白酶的研究现状,临床应用情况,以及临床常用的一些成熟药物。