重组BJ46a蛋白抑制B16细胞的体外侵袭及转移

目的探讨蛇毒金属蛋白酶抑制剂BJ46a的抗肿瘤侵袭及转移作用。方法以蛇毒金属蛋白酶抑制剂BJ46a为目的基因,选择杆状病毒表达系统生产重组BJ46a蛋白,纯化并测定其生物学活性;利用Alamar blue法及Transwell小室分析法评价重组蛋白对小鼠黑色素瘤细胞B16体外生长、黏附、运动和侵袭能力的影响(n=3)。结果经ProBond亲和层析纯化出的重组BJ46a蛋白具有抑制基质金属蛋白酶(MMPs)的活性;经重组BJ46a蛋白处理的B16细胞穿过Matrigel的细胞数明显低于对照组(P<0.01),抑制率为84.8%。结论重组BJ46a蛋白能抑制B16细胞的侵袭转移。

BJ46a基因在昆虫细胞的转染、蛋白表达及超微结构观察

目的研究蛇毒金属蛋白酶抑制剂BJ46a在杆状病毒表达系统的表达及宿主细胞Sf9超微结构的变化。方法将构建的杆状病毒重组穿梭载体Bacmid BJ46a,经Cellfectin脂质体介导转染Sf9昆虫细胞,获重组杆状病毒颗粒;以高滴度病毒感染Sf9昆虫细胞,行Western blot观察BJ46a融合蛋白的表达。在病毒扩增、蛋白表达过程应用透射电镜和超薄切片技术观察Sf9细胞超微结构的变化。结果Western blot分析表明:在转染病毒的Sf9细胞出现BJ46a融合蛋白表达条带。电镜观察表明:Sf9细胞在病毒扩增过程,细胞核增大,病毒发生基质形成,杆状病毒在其周围装配。蛋白表达期间,杆状病毒量剧增,细胞核内外存在大量丝状纤维。结论BJ46a基因可在杆状病毒表达系统成功表达,并伴随着宿主细胞超微结构的显著变化,其结果为杆状病毒表达系统的研究奠定坚实的基础。

蛇毒金属蛋白酶抑制剂基因的合成及杆状病毒表达载体的构建

研究蛇毒金属蛋白酶抑制剂(BJ46a)基因的合成及杆状病毒表达载体的构建。根据GenBank中查找的BJ46a基因序列(AF294836),将其分为20个片段,通过缓慢退火PCR法使之拼接为完整的BJ46a基因,经SacⅠ及XhoⅠ双酶切后定向克隆到载体pET-42a(+)中,PCR扩增、酶切及测序鉴定;根据测序结果用定点突变法逐一改正错误位点。随后将该基因插入到转座载体pFastBac HT C的MCS中,转化大肠杆菌DH5-αT1,以LB/AP平板筛选阳性重组子,PCR扩增、酶切鉴定,提取pFastBac HT C-BJ46a重组体进一步转化DH10Bac感受态细胞,48h后通过蓝白筛选,挑取单个白色菌落划线,证实所得菌落均为白斑,挑克隆PCR鉴定。结果表明成功构建杆状病毒重组转座载体、重组穿梭载体。含BJ46a基因的重组杆状病毒感染Sf 9昆虫细胞,获得目的蛋白的表达。BJ46a基因的合成及杆状病毒表达载体的成功构建,为进一步研究其生物学功能奠定了坚实的基础。

蛇毒金属蛋白酶抑制剂对小鼠黑色素转移瘤血管生成拟态形成的影响

目的：研究蛇毒金属蛋白酶抑制剂BJ46a对血管生成拟态形成的影响。方法：将BJ46a基因转染B16细胞，建立稳定转染的B16／pcDNA3．1HisC-BJ46a细胞株，通过C57BL／6小鼠实验性肺转移模型，模拟肿瘤细胞降解局部细胞外基质、进而侵袭转移过程，应用光镜和超薄切片透射电镜技术观察BJ46a基因转染对血管生成拟态形成的影响。结果：小鼠黑色素瘤内存在血管生成拟态，稳定转染的B16／pcDNA3．1HisC—BJ46a细胞株抑制其肿瘤血管生成拟态的形成。结论：BJ46a通过抑制血管生成拟态形成，从而抑制肿瘤的侵袭转移。

蛇毒金属蛋白酶抑制剂抗小鼠黑色素瘤肺转移

探讨蛇毒金属蛋白酶抑制剂BJ46a抗肿瘤侵袭转移作用。以BJ46a为目的基因,选择杆状病毒表达系统生产重组BJ46a蛋白,ProBondTM亲和层析纯化后处理黑色素瘤细胞B16,经尾静脉接种C57BL/6小鼠,建立B16细胞实验性肺转移模型,20天后以颈椎脱臼法处死小鼠,观察肺组织病理学变化。结果表明:不同浓度重组BJ46a蛋白处理组肺部转移瘤数分别为1.1±0.83、0.9±0.7,明显低于对照组(6.3±3.00,P<0.001)和空白对照组(10.7±5.73,P<0.001),光镜下对照组肿瘤病理学征象明显,而重组BJ46a蛋白处理组瘤结节小。研究结果首次证明了重组BJ46a蛋白能抑制小鼠黑色素瘤细胞的侵袭转移,为其作为抗肿瘤侵袭转移药物的进一步研制和开发应用提供理论依据和前提条件。